李 櫻 綜述 單煜恒 審校

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染腦膜引起的非化膿性炎癥，具有病死率高，發(fā)病年齡低等特點(diǎn)。即使經(jīng)過(guò)規(guī)范化治療，依然有超過(guò)1/3的患者死亡，存活的患者也常遺留有多種神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1]。早期診斷和及時(shí)、規(guī)范的治療是改善TBM預(yù)后的重要手段。然而，由于臨床表現(xiàn)缺乏特異性、檢驗(yàn)手段缺乏敏感性，部分患者在疾病早期難以得到準(zhǔn)確診斷[2]。

診斷TBM的關(guān)鍵在于對(duì)腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中Mtb的檢測(cè)，常規(guī)檢測(cè)方法包括涂片染色鏡檢法及Mtb培養(yǎng)法[3]。但這兩種常規(guī)方法耗時(shí)長(zhǎng)且敏感度低，難以實(shí)現(xiàn)TBM的早期診斷[4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)擴(kuò)增Mtb特異性堿基序列(探針?lè)?、利用基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)微生物種類(測(cè)序法)等分子檢測(cè)技術(shù)逐漸應(yīng)用于Mtb的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。以其標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，及時(shí)高效的診斷效能，這些分子檢測(cè)技術(shù)逐漸成為目前TBM實(shí)驗(yàn)室診斷的研究熱點(diǎn)。本文將圍繞不同分子檢測(cè)技術(shù)在TBM診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀和前景進(jìn)行綜述。

1 Amplicor與COBAS TaqMan MTB技術(shù)

由瑞士Roche公司研發(fā)的Amplicor是首批應(yīng)用于Mtb實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的商業(yè)化試劑盒。該技術(shù)利用特異性引物選擇性擴(kuò)增16S rRNA基因中一個(gè)長(zhǎng)為584 bp 的DNA片段，再將擴(kuò)增子與生物素標(biāo)記的特異性探針雜交，進(jìn)而利用酶聯(lián)免疫技術(shù)進(jìn)行比色鑒定，當(dāng)660 nm的吸光度值(OD660)>0.35時(shí)，判讀為Mtb陽(yáng)性[5]。在2003年的一項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，Amplicor診斷TBM的敏感度僅為55.6%，近半數(shù)患者呈現(xiàn)為假陰性。而當(dāng)調(diào)整判讀閾值后(OD660>0.2)Amplicor的特異度又大幅下降。鑒于Amplicor技術(shù)在診斷效能中的缺陷，Roche公司在其基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了COBAS TaqMan MTB技術(shù)。該技術(shù)是首個(gè)基于TaqMan探針的診斷檢測(cè)方法。2011年，Kim應(yīng)用Amplicor及COBAS TaqMan MTB技術(shù)對(duì)406個(gè)CSF樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)陽(yáng)性為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，Amplicor診斷TBM的敏感度與特異度分別為58.3%與99.5%，而COBAS TaqMan MTB的敏感度與特異度分別為79.1%與98.2%[6]。這一結(jié)果提示，COBAS TaqMan MTB技術(shù)在TBM 診斷中具有較為理想的診斷效能及應(yīng)用前景。

2 Mtb核酸直接擴(kuò)增(amplified Mtb direct test，AMTD)技術(shù)

與Amplicor類似，由美國(guó)Gene-probe公司研發(fā)的AMTD技術(shù)也是一種早期應(yīng)用于Mtb檢測(cè)的分子診斷技術(shù)。該技術(shù)使用轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增的方法擴(kuò)增Mtb的16S rRNA，并利用吖啶脂標(biāo)記的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，從而進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。由于rRNA在Mtb細(xì)胞中具有較高的拷貝數(shù)，因此AMTD技術(shù)也具有較高的敏感度。Chedore通過(guò)對(duì)311個(gè)CSF樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，AMTD診斷TBM的敏感度與特異度分別為94%及99%。在另一項(xiàng)研究中，Lang等[7]發(fā)現(xiàn)AMTD在抗酸染色陰性的TBM患者中也具有良好的診斷效能，敏感度可達(dá)83%。該技術(shù)可在2.5 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣本中Mtb的快速檢測(cè)，且整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在單一溫度及反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，易于操作且不易污染。但是，由于rRNA只存在于活的Mtb細(xì)胞中，因此抗結(jié)核治療可能會(huì)影響AMTD的檢測(cè)結(jié)果。

3 環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)

LAMP技術(shù)是由日本Eiken Chemical公司研發(fā)的一種快速、簡(jiǎn)便且有效的DNA擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)屬于恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的一種，僅需要2h即可完成對(duì)Mtb的鑒定[8]。LAMP可應(yīng)用多種引物分子探針實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶基因的擴(kuò)增。其中，最常用的靶基因位點(diǎn)為IS6110，其次為MPB64。2011年，Nagdev[9]通過(guò)對(duì)27例TBM患者的CSF樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，LAMP(IS6110)診斷TBM的敏感度為88%，特異度為80%。在另一項(xiàng)研究中，Modi等[10]通過(guò)對(duì)250例TBM患者及100例非TBM患者的CSF進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)LAMP(IS6110)及LAMP(MPB64)診斷TBM的敏感度分別為87%及88%。上述結(jié)果提示LAMP對(duì)于TBM具有良好的診斷效能。但是，LAMP 技術(shù)也存在明顯不足。首先，應(yīng)用于LAMP的引物分子探針設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，且不同的引物分子探針的診斷效能不一。其次，LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物常帶有核酸內(nèi)切酶殘端，無(wú)法直接進(jìn)行定量分析，只能對(duì)擴(kuò)增片段的有無(wú)進(jìn)行定性分析。

4 分子線性探針技術(shù)(molecular line probe assay，LPA)

LPA主要應(yīng)用于多耐藥性Mtb的檢測(cè)。該技術(shù)使用能夠靶向擴(kuò)增Mtb耐藥基因的特異性引物，將擴(kuò)增子與生物素標(biāo)記的分子探針雜交，利用化學(xué)顯色技術(shù)進(jìn)行結(jié)果判讀。目前，應(yīng)用LPA檢測(cè)Mtb的方法主要有兩種：靶向利福平(rifampin，RIF)耐藥基因rpoB的INNO-LiPA Rif TB Assay和靶向異煙肼耐藥基因katG、inhA的GenoType MTBDRplus[11]。2015年，Solomons等[12]檢測(cè)了GenoType MTBDRplus的診斷效能，發(fā)現(xiàn)以TBM臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，該檢測(cè)技術(shù)的敏感度為33%，特異度為98%。雖然LPA對(duì)TBM診斷的敏感度并不理想，但是該技術(shù)對(duì)于Mtb耐藥性的檢測(cè)非常準(zhǔn)確，敏感度與特異度均超過(guò)95%。

5 GeneXpert MTB/RIF技術(shù)

GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱Xpert)技術(shù)是一種以全自動(dòng)半巢式實(shí)時(shí)定量熒光PCR為基礎(chǔ)，rpoB基因?yàn)榘悬c(diǎn)，利用GeneXpert平臺(tái)自動(dòng)提取DNA并擴(kuò)增的一種分子檢測(cè)技術(shù)[13]。該技術(shù)應(yīng)用5種相互重疊的引物分子探針，選擇性擴(kuò)增與RIF耐藥相關(guān)的rpoB基因核心區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Mtb DNA及RIF耐藥性的同時(shí)檢測(cè)。它具有方便、快速等特點(diǎn)，約2 h即可讀取結(jié)果。結(jié)果判讀依靠探針的循環(huán)閾值，即Ct值。當(dāng)不少于2個(gè)探針的Ct值≤38時(shí)，即可判讀為Mtb陽(yáng)性，當(dāng)探針的早期與晚期Ct值之差>3.5時(shí)，即提示Mtb對(duì)RIF耐藥[14]。自2009年由美國(guó) Cepheid 公司研發(fā)以來(lái)，Xpert技術(shù)逐步應(yīng)用于臨床，并于2010年及2013年先后經(jīng)過(guò)世界衛(wèi)生組織及美國(guó)藥品食品監(jiān)督局批準(zhǔn)，成為診斷TMB的一線方法[15]。

2014年，Denkinger等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)，以Mtb培養(yǎng)陽(yáng)性為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，Xpert診斷TBM的敏感度超過(guò)80%，而以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，其敏感度也可達(dá)到60%。2018年，Kohli等[17]對(duì)33項(xiàng)關(guān)于Xpert診斷TMB的研究進(jìn)行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)Xpert診斷TMB的合并敏感度為71%、合并特異度為98%。自Xpert檢測(cè)系統(tǒng)得到國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)后，我國(guó)部分醫(yī)院也開(kāi)展這一檢測(cè)技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)陽(yáng)性為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，其診斷TBM的敏感度約為80%，而以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，其敏感度約為50%[18-20]。上述結(jié)果提示，Xpert對(duì)于TBM的診斷具有良好的診斷效能。但是，價(jià)格高、通量小的特點(diǎn)限制其在基層醫(yī)院的廣泛應(yīng)用。而且，早期應(yīng)用該技術(shù)是否能夠改善TBM患者的總體預(yù)后還有待進(jìn)一步研究。

6 Xpert MTB/RIF Ultra技術(shù)

Xpert MTB/RIF Ultra(簡(jiǎn)稱Xpert Ultra)技術(shù)是在Xpert技術(shù)基礎(chǔ)上的發(fā)展與改進(jìn)，兩者在檢測(cè)原理及操作流程等方面基本相同。而Xpert Ultra技術(shù)應(yīng)用了更豐富的引物分子探針，不僅包括原有的4種靶向rpoB基因的引物分子探針，還包括2種靶向多拷貝序列IS6110和ISl081的引物分子探針。這一改動(dòng)使Xpert Ultra具有較低的檢測(cè)閾值，從而提高了Mtb檢測(cè)的陽(yáng)性率。2018年，Bahr[21]開(kāi)展了一項(xiàng)包括129例TBM患者的診斷實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)、Xpert或Xpert Ultra陽(yáng)性為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，Xpert Ultra的敏感度為95%，高于Mtb培養(yǎng)及Xpert的敏感度，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而在近期發(fā)表的一項(xiàng)前瞻性診斷實(shí)驗(yàn)中，Donovan等[22]發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)陽(yáng)性為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，Xpert Ultra及Xpert診斷TBM的敏感度分別為59.5%及55.3%，而以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，兩者的敏感度分別為47.2%及37.6%，均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，Xpert Ultra技術(shù)在診斷TBM中是否優(yōu)于Xpert技術(shù)尚需要進(jìn)一步研究及薈萃分析。

7 宏基因組二代測(cè)序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技術(shù)

mNGS技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的基因測(cè)序技術(shù)，具有成本低、通量高、速度快等特點(diǎn)，能夠檢測(cè)樣本中微生物的全部遺傳信息。這種檢測(cè)技術(shù)不需要制備特異性的分子引物，無(wú)差別的對(duì)樣本中所含的全部病原體進(jìn)行篩查，通過(guò)與基因庫(kù)信息比對(duì)，確定潛在的致病菌。理論上，mNGS在TBM的診斷中具有一定的應(yīng)用前景。2019年，邢小微[23]在關(guān)于mNGS診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以Mtb培養(yǎng)或Xpert為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，mNGS診斷TBM的敏感度為60%、特異度為96%。在同年的另一項(xiàng)相關(guān)的研究中，Wang等[24]得到了類似的結(jié)果，在該研究中mNGS診斷TBM的敏感度為66%。但是，mNGS在TBM診斷的應(yīng)用中還存在諸多問(wèn)題。首先，mNGS的檢測(cè)結(jié)果并不唯一，?？稍跈z測(cè)中發(fā)現(xiàn)其他致病微生物的存在，使得結(jié)果難以判讀；其次，標(biāo)本提取、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等操作過(guò)程中可能帶來(lái)外源性核酸污染，使mNGS結(jié)果的可信性大為下降；再次，關(guān)于mNGS診斷TBM的研究不足，證據(jù)欠缺，也尚無(wú)相關(guān)指南及共識(shí)推薦。

近年來(lái)，隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，應(yīng)用于診斷TBM的分子檢測(cè)技術(shù)層出不窮。這些檢測(cè)技術(shù)具有快速、可重復(fù)及高通量等優(yōu)點(diǎn)，但是也存在很多問(wèn)題亟待解決。首先，CSF的低含菌量問(wèn)題不僅影響傳統(tǒng)檢測(cè)方法的Mtb檢出率，也影響分子檢測(cè)技術(shù)的Mtb檢出率。增加CSF樣本含量并在檢測(cè)前離心處理可能對(duì)于提高分子檢測(cè)技術(shù)的敏感性有一定作用，但尚需相關(guān)研究證實(shí)。其次，診斷TBM的金標(biāo)準(zhǔn)尚有爭(zhēng)議，而且相關(guān)研究對(duì)金標(biāo)準(zhǔn)的選擇并不一致。不同的金標(biāo)準(zhǔn)選擇會(huì)得到分子檢測(cè)技術(shù)不同的診斷效能。比如，應(yīng)用Mtb培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，可能會(huì)高估分子檢測(cè)技術(shù)的敏感度并低估其特異度；而應(yīng)用臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，則可能會(huì)低估分子檢測(cè)技術(shù)的敏感度并高估其特異度。第三，分子檢測(cè)技術(shù)較傳統(tǒng)的Mtb檢測(cè)方法更為昂貴，而且在基層醫(yī)院難以開(kāi)展。

雖然存在以上不足，但是分子檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展已將Mtb的檢測(cè)從細(xì)胞水平提升至分子水平。在今后的研究中，如何降低檢測(cè)費(fèi)用并提高分子檢測(cè)技術(shù)的診斷效能將成為相關(guān)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。另外，建立一套全面的臨床應(yīng)用綜合評(píng)價(jià)系統(tǒng)也將有助于分子檢測(cè)技術(shù)在TBM臨床診斷中的進(jìn)一步應(yīng)用與開(kāi)展。