牟方婷，袁美，石黎琳，曾凡坤，陳嘉，張玉

(西南大學 食品科學學院， 重慶，400715)

果膠是聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織、世界衛(wèi)生組織聯(lián)合專家委員會公認的安全無毒的天然、無每日攝入量限制的食品添加劑[1]。它是一種普遍存在于高等植物的初生細胞壁和細胞中間片層的酸性雜多糖物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)由α-1,4-糖苷鍵連接D-半乳糖醛酸殘基組成的長鏈聚合物，多聚半乳糖醛酸鏈構(gòu)成果膠的主鏈骨架,主鏈上連接的側(cè)鏈由大量的中性糖(20余種)組成[2]。由于未改性果膠分子質(zhì)量大，在腸道內(nèi)難以消化，導致其生物學功能等在多方面的應用受到限制，而改性后的果膠分子質(zhì)量較小，可以被小腸吸收而進入到血液中[3]。研究表明，改性果膠具有促進雙歧桿菌增長[4-5]，抑制食源性病菌繁殖[6]，預防心功能障礙[7]，抗癌[8-10]等多種功能，在天然食品防腐添加劑及功能食品的開發(fā)等領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。

近年來，大量研究者越來越重視果膠的構(gòu)效關(guān)系，研究果膠降解方法及其降解產(chǎn)物的生物學活性成為了熱點。目前，降解果膠的方法主要有化學改性法(酸堿法脫酯)、生物改性法(酶法脫酯)及物理改性法(高溫、高壓等處理)，其中酶法改性果膠的產(chǎn)物分子質(zhì)量較高，反應底物有專一性[11]。超聲波和微波是近年來興起的綠色環(huán)保的聚合物降解方法[12-15]，但在國內(nèi)關(guān)于超聲波和微波輔助果膠酶降解果膠應用方面的報道還較少。因此，本研究將超聲波和微波應用于果膠降解的酶解底物和酶解產(chǎn)物中，探究超聲波時間、功率和微波時間、溫度、功率對果膠酶促降解效果的影響，并運用現(xiàn)代分析技術(shù)，從果膠降解產(chǎn)物的分子質(zhì)量及其分布、單糖組成測定、紅外光譜和掃描電鏡分析，探究不同降解方法對果膠分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘果膠(≥99%)、果膠酶(40 U/mg)，索萊寶生物科技有限公司；單糖標準品(≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；聚乙二醇(polyetyhlene glycol，PEG)標樣組(≥99%)，日本Tosoh(TSK 東曹)公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyraz-olone，PMP)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇(色譜級)，成都市科龍化工試劑廠；KBr(色譜級)，成都科隆化學品有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY98-ⅢDN超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；MAS-Ⅱ微波快速制樣系統(tǒng)，新儀微波化學科技有限公司；HWS26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；UV—6100紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；Ultimate 3000液相色譜儀，美國賽默飛公司；LC20液相色譜儀，日本島津公司；E-201-CpH計，上海儀電科學儀器有限公司；TF-HFD-4真空冷凍干燥機，上海田楓實業(yè)有限公司；YP-2壓片機，上海山岳科學儀器有限公司；Spectrun100傅里葉紅外光譜，美國Perkin Elmer公司；AVANCE III核磁共振譜儀，瑞士Bruker公司；Phenom Pro掃描電鏡，荷蘭Phenom World公司。

1.3 方法

1.3.1 半乳糖醛酸標準曲線的制作

根據(jù)廖祥兵等[16]優(yōu)化的3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法測定還原糖含量的方法。準確稱取半乳糖醛酸標準品10 mg，去離子水溶解，定容至10 mL，配成1 mg/mL的半乳糖醛酸標準溶液。取8支10 mL具塞刻度管，依次加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL半乳糖醛酸標準溶液，用蒸餾水將各管補足至1 mL，加入2.0 mL的3,5-二硝基水楊酸，置于沸水浴中反應5 min，流水冷卻，加去離子水稀釋至10 mL，搖勻，在波長為540 nm下記錄吸光值。以吸光值為縱坐標，半乳糖醛酸質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線得到方程：y=1.657 5x-0.153 8，R2=0.998 83。

1.3.2 果膠酶降解果膠

1.3.2.1 柑橘果膠酶解

用pH為4.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液,分別配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL的柑橘果膠酶溶液和質(zhì)量濃度為1 mg/mL的柑橘果膠溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。準確吸取900 μL柑橘果膠溶液于10 mL比色管中，預熱，加入100 μL不同濃度梯度(0.016、0.032、0.04、0.048、0.056、0.064、0.08 U/mL)的果膠酶溶液，于不同溫度(30、35、40、45、50、60 ℃)下保溫不同時間(10、30、50、60、70、80、90、100 min)。反應結(jié)束后，立即浸入100 ℃沸水中水浴3 min以滅活果膠酶。

1.3.2.2 超聲波聯(lián)合酶解

采用單因素實驗設(shè)計的方法，研究超聲波輸出功率(10%、20%、25%、30%、35%、40%、50%，總功率1 200 W)和超聲波作用時間(10、20、25、30、35、40、50 min)2個因素對超聲處理酶解底物和酶解產(chǎn)物效果的影響。實驗所用超聲波細胞粉碎儀功率1 200 W、頻率20 kHz，占空比為1∶1(脈沖時間2 s、間歇時間2 s)，處理的果膠溶液體積為30 mL，處理過程中，超聲波探針插入樣品液面下約1 cm處，溫度探針沒入樣品溶液，樣品溫度設(shè)置為40 ℃。

1.3.2.3 微波聯(lián)合酶解

采用單因素實驗設(shè)計的方法，研究微波處理時間(15、20、25、30、35、40、45 min)、微波處理溫度(40、60、70、80、90、100 ℃)、微波處理功率(400、500、600、700、800、900 W)3個因素對微波處理酶解底物和酶解產(chǎn)物效果的影響。采用MAS-Ⅱ微波快速制樣系統(tǒng)，取配好的柑橘果膠溶液100 mL，加酶后，移入三口燒瓶中，連接冷凝水，放入磁力攪拌子，設(shè)置磁力攪拌速度200 r/min。

1.3.3 不同降解方法對果膠樣品分子質(zhì)量及其分布的影響

采用凝膠滲透色譜測定果膠的分子質(zhì)量及其分布[17]，果膠的分子質(zhì)量以其重均分子質(zhì)量(MW)表示，其多分散性系數(shù)為果膠的重均分子質(zhì)量與數(shù)均分子質(zhì)量的比值(=MW/MN)。

檢測條件：色譜儀Shimadzu LC20，色譜柱為TSKgel GMPWXL水相凝膠色譜柱，柱溫35 ℃，進樣體積20 μL，流動相為0.1 mol/L NaNO3+0.06% NaN3水溶液，流速0.6 mL/min。

標準曲線的繪制：稱取窄分布聚乙二醇標樣組溶于超純水，根據(jù)不同分子質(zhì)量標品(2.0、146.0、903.0 kDa)在色譜圖上保留時間與其對應的分子質(zhì)量的對數(shù)做出標準曲線。樣品的檢測：準確稱取果膠樣品，溶于水，配制成0.2 mg/mL過0.45 μm水膜，待檢測。

1.3.4 不同降解方法對果膠樣品單糖組成的影響

采用高校液相色譜法測定果膠單糖的含量，方法參照YANG等[18]，精密稱取甘露糖(Man)，核糖(Rib)，氨基葡萄糖(Glus)，氨基半乳糖(Gals)，鼠李糖(Rha)，葡萄糖醛酸(GluA)，半乳糖醛酸(Gal A)，葡萄糖(Glu)，半乳糖(Gal)，巖藻糖(Fuc)，木糖(Xyl)，阿拉伯糖(Ara)標準品適量，加水溶解稀釋至1 mL中各含50 μg的混合標準溶液。精確吸取250 μL混合對照溶液到5 mL離心管中，加入0.6 mol/L的NaOH 250 μL以及0.4 mol/L的PMP-甲醇溶液500 μL，70 ℃反應1 h。冷水浴冷卻10 min后，加入500 μL 0.3 mol/L的HCl中和，再加1 mL氯仿，漩渦1 min，3 000 r/min離心10 min，小心取上清，萃取3次。上清液用于高效液相色譜檢測。

果膠樣品的水解和衍生化：精密稱取樣品置于5 mL安剖瓶中，加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸，封管，110 ℃條件下酸解8 h。取出，揮干三氟乙酸，加2.0 mL水復溶。取250 μL樣品水解液，按照標準品衍生的方法進行衍生化。

色譜儀：Ultimate 3000，色譜柱：Xtimate C184.620 0 mm，5 μm，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，檢測波長：250 nm，進樣量：20 μL，流動相：0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為6.70)-乙腈溶液，體積比83∶17。

1.3.5 不同降解方法對果膠樣品紅外光譜的影響

取樣品與干燥的KBr混勻，研磨均勻，壓片(壓力30 MPa以上)，制成透明或半透明的樣品薄片。用美國PerkinElmer公司 Spectrun100傅里葉紅外光譜儀進行掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，導出掃描結(jié)果，用Origin9.1作圖并分析。

1.3.6 不同降解方法對果膠樣品表觀形態(tài)的影響

輕刮取少量果膠原料及凍干后的及降解樣品，將它們均勻粘在導電膠上，噴金制樣后置于掃描電子顯微鏡中，觀察其結(jié)構(gòu)形態(tài)。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0，作圖采用Origin 2017。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘果膠酶解

隨著酶濃度的增加，低聚半乳糖醛酸的生成量也逐漸增長(P<0.05)。當酶濃度低于1.0 mg/mL時，低聚半乳糖醛酸生成量隨著酶濃度的增長顯著增加，當酶濃度達到一定值(1.0 mg/mL)時，反應速度增長緩慢,考慮酶的成本，故酶添加量選擇0.04 U/mL(圖1-a)。酶解溫度在30～35 ℃時，隨著溫度的升高，低聚半乳糖醛酸生成量顯著提高，而在35～45 ℃時，低聚半乳糖醛酸的生成量隨著溫度的增加增長趨勢變緩，當溫度>45 ℃，低聚半乳糖醛酸的生成量急劇下降(圖1-b)。在前60 min，隨著反應時間的延長低聚半乳糖醛酸生成量迅速增加(P<0.05)，當反應時間超過60 min以后，生成速率明顯趨于緩慢(P>0.05)(圖1-c)。因此，果膠酶解的最佳反應條件為：酶濃度0.04 U/mL，溫度45 ℃，時間60 min。

a-酶濃度；b-酶解溫度；c-反應時間圖1 酶濃度、酶解溫度和反應時間對低聚半乳糖醛酸生成量的影響Fig.1 The effect of enzyme concentration,reaction temperature and time on the yield of oligosalacuronic acid

2.2 超聲波作用條件對酶促降解果膠的影響

在超聲處理30 min時，超聲功率對果膠降解效果的影響如圖2-a所示。酶解底物在超聲功率10%～30%時，低聚半乳糖醛酸生成量迅速增加，當超聲功率再增加時，果膠酶促降解效率提高不大且有下降趨勢；酶解產(chǎn)物在超聲功率10%～40%時，低聚半乳糖醛酸的生成量從最低增加到最大，功率超過40%時，低聚半乳糖醛酸的生成量反而有下降趨勢。在超聲功率為30%時，超聲時間對果膠降解效果的影響如圖2-b所示。酶解底物在超聲處理40 min時低聚半乳糖醛酸生成量達到最大，超過40 min時，生成量呈下降趨勢；酶解產(chǎn)物在30 min時低聚半乳糖醛酸生成量達到最大，當超聲時間超過30 min，超聲降解效果不明顯。

a-超聲功率；b-超聲時間圖2 超聲功率和超聲時間對酶降解底物和產(chǎn)物的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power and time on enzymatic degradation of substrates and products

因此，超聲波處理果膠酶解底物選擇超聲功率30%，處理40 min為宜；處理果膠酶解產(chǎn)物選擇超聲功率40%，處理30 min效果較好。

2.3 微波作用條件對酶促降解果膠的影響

微波時間、微波溫度及微波功率對果膠降解效果的影響見圖3。在微波溫度為70 ℃，功率為600 W的條件下，酶解底物在微波輻照時間為10～30 min時，低聚半乳糖醛酸生成量逐漸增加，超過30 min時低聚半乳糖醛酸生成量有下降趨勢；酶解產(chǎn)物在微波處理前期，果膠降解效率不斷提高，達到40 min后，持續(xù)增加微波輻照時間并不能有效地提高降解率(圖3-a)。在微波輻照時間30 min，功率600 W的條件下，隨著處理溫度的提高(酶解底物)，低聚半乳糖醛酸生成量逐步增加，但當溫度超過100 ℃時，果膠溶液發(fā)生暴沸，不利于試驗的進行；酶解產(chǎn)物在40～70 ℃時，低聚半乳糖醛酸生成量逐漸增加，當溫度超過70 ℃之后，溫度對酶促降解效率影響并不大(圖3-b)。在微波處理時間30 min，溫度100 ℃的條件下，酶解底物在微波處理功率為300～700 W時，低聚半乳糖醛酸生成量迅速增加，當微波功率超過700 W后，低聚半乳糖醛酸生成量呈下降趨勢；果膠酶解產(chǎn)物經(jīng)微波溫度70 ℃，處理30 min時，微波功率在400～800 W時，低聚半乳糖醛酸的生成量逐漸增加到最大，當微波功率超過800 W之后，功率的增加并不能有效的提高果膠降解的效率(圖3-c)。

a-微波時間；b-微波溫度；c-微波功率圖3 微波時間、溫度與功率對酶降解底物和產(chǎn)物的影響Fig.3 Effects of microwave time,temperature and power on enzymatic degradation of substrates and products

因此，微波處理果膠酶解底物選擇在微波功率700 W，100 ℃下處理30 min為宜；微波處理果膠酶解產(chǎn)物選擇在微波溫度70 ℃，功率800 W條件下處理40 min為宜。

2.4 不同降解方法對果膠樣品分子質(zhì)量及其分布的影響

采用凝膠滲透色譜測定果膠樣品分子質(zhì)量，出峰時間越早，則表示保留時間越短，因此樣品分子質(zhì)量越大[19]。由圖4可以看出，原果膠(CP)出峰時間最早，分子質(zhì)量也最大，為283 kDa。而果膠酶解果膠(EP)、微波處理酶解底物(MEPⅠ)、微波處理酶解產(chǎn)物(MEPⅡ)、超聲波處理酶解底物(UEPⅠ)、超聲波處理酶解產(chǎn)物(UEPⅡ)的出峰時間和形狀大體相同，其分子量之間沒有顯著性差異，但都比原果膠小，說明果膠酶、超聲波和微波有都在一定程度上降解了果膠。

圖4 不同降解方法制備的果膠的分子質(zhì)量Fig.4 Molecular weight of pectin prepared by different degradation methods

EP、MEP Ⅰ、MEP Ⅱ、UEP Ⅰ、UEP Ⅱ的分子質(zhì)量及其分散性系數(shù)如表1所示。幾種降解果膠的重均分子質(zhì)量均比原果膠(283 kDa)低56.18%以上，表明果膠酶降解果膠具有顯著的降解效果。EP(1.23)、MEP Ⅰ(1.22)、MEP Ⅱ(1.22)、UEP Ⅰ(1.23)、UEP Ⅱ(1.22)的多分散性系數(shù)比原果膠(4.26)明顯降低，幾種降解果膠之間沒有明顯差異(P>0.05)，由此可知降解果膠的分子質(zhì)量分布更窄，果膠分子分布更集中。

2.5 不同降解方法對果膠樣品單糖組成的影響

單糖組成能反映果膠的結(jié)構(gòu)特征，對其性質(zhì)和生物活性有重要影響[20-21]。果膠原料及幾種不同降解產(chǎn)物的單糖組成(以mol%的形式表示)如表1所示。

表1 不同降解果膠的單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of different degraded pectin

果膠經(jīng)酶解和超聲、微波輔助酶解之后，其單糖類型未發(fā)生改變，但其含量發(fā)生了顯著或不顯著的變化。MEPⅠ、MEPⅡ、UEPⅠ、UEPⅡ與酶解果膠和原果膠相比，Gal、Ara和Rha含量明顯下降，GalA含量明顯上升，這與ZHANG等[22]超聲處理30 min時GalA含量的變化一致。酶解果膠GalA含量由原果膠33.71%提高到39.57%，這是由于果膠酶能使HG區(qū)半乳糖醛酸主鏈間的糖苷鍵斷裂[23]。MEPⅠ、MEP Ⅱ、UEP Ⅰ 及UEP Ⅱ 的GalA含量分別達到了60.27%、58.12%、65.96%和63.75%，相比酶解果膠39.57%分別提高了52.31%、46.88%、66.69%、61.11%。超聲的空化機械作用導致果膠的降解，使其單糖的含量發(fā)生變化，半乳糖最不穩(wěn)定，而半乳糖醛酸對高強度超聲最有抵抗力[22]。微波的熱效應主要是分子之間振動所產(chǎn)生的機械剪切作用，使糖苷鍵斷裂，導致大分子果膠降解。綜上，經(jīng)超聲、微波作用能明顯的提高GalA的含量，且利用超聲和微波處理酶解底物輔助果膠酶效果更好。

用Rha/GalA代表果膠主鏈的變化，GalA/ (Gal+Ara+Rha)表示中性糖側(cè)鏈的變化[24]。相比于原果膠，幾種降解果膠Rha/GalA明顯降低，GalA/ (Gal+Ara+Rha)顯著提高，表明酶促降解、微波輔助果膠酶降解和超聲波輔助果膠酶降解對果膠主鏈降解效果明顯，使果膠結(jié)構(gòu)中鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I型的含量增加，且果膠的側(cè)鏈也發(fā)生了明顯的降解，因此超聲波和微波輔助酶解都能明顯加強降解效果。根據(jù)有關(guān)文獻[25]報道，這可能是由于果膠酶以未被酯化的多聚半乳糖醛酸作為底物，超聲波作用下GalA上甲氧基的移除使果膠酶與底物的作用位點更多，親和力更強，從而進一步促進果膠主鏈的降解程度。

2.6 不同降解方法對果膠樣品紅外光譜的影響

1-CP；2-EP；3-MEPⅠ；4-MEPⅡ；5-UEPⅠ；6-UEPⅡ圖5 不同方法降解果膠的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of pectin degradation by different methods

2.7 不同降解方法對果膠樣品表觀形態(tài)的影響

圖6為原果膠及不同方法制備的降解果膠樣品冷凍干燥后的×1 000倍數(shù)下的掃描電鏡圖，從果膠樣品的表面形態(tài)特征可以看出果膠酶、微波、超聲都影響了果膠的微觀結(jié)構(gòu)。具有差異性的微觀結(jié)構(gòu)意味著微波和超聲處理也許能破壞果膠分子之間的交聯(lián)并重組了果膠分子間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[25]。如圖6-a所示，原果膠表面結(jié)構(gòu)呈不規(guī)則條狀或塊狀，結(jié)構(gòu)緊實表面粗糙。圖6-b酶解果膠呈帶孔徑的片狀，由于吸水聚集黏結(jié)成團狀，在較大放大倍數(shù)(×1 000倍)下可以看到表面光滑，有少許細小孔洞。圖6-e，圖6-f為微波處理的果膠，其結(jié)構(gòu)聚集成團狀，且有些許孔徑。而經(jīng)過超聲處理的果膠(圖6-c，圖6-d)與前幾種果膠相比，在較大放大倍數(shù)(×1 000倍)下可以看到明顯密且大的孔洞。分析表明，用不同方法降解的果膠可能表現(xiàn)出不同的形態(tài)。

a-CP;b-EP;C-UEPⅠ;d-UEPⅡ;e-MEPⅠ;f-MEPⅡ圖6 原果膠及不同降解果膠掃描電子顯微鏡圖(×1 000圖)Fig.6 Sacnning electron microscopy of initial pectin and different degraded pectin

3 結(jié)論

采用超聲波和微波輔助果膠酶制備改性柑橘果膠，同時對其改性工藝條件進行研究，以期增強果膠的功能性，擴展其應用范圍。通過單因素試驗得到幾種降解方式的最佳工藝條件，果膠酶降解果膠：酶濃度0.04 U/mL，溫度45 ℃，時間60 min；超聲波處理果膠酶解底物：超聲功率30%，處理40 min，超聲波處理果膠酶解產(chǎn)物：超聲功率40%，處理30 min；微波處理果膠酶解底物：微波功率700 W，100 ℃下處理30 min，微波處理果膠酶解產(chǎn)物：微波溫度70 ℃，功率800 W條件下處理40 min。

酶解、超聲輔助酶解以及微波輔助酶解均能有效降低果膠的分子質(zhì)量，且降解果膠的分子質(zhì)量分布更窄，果膠分子分布更集中。果膠經(jīng)酶解和超聲、微波輔助酶解不改變果膠的單糖類型，但經(jīng)超聲、微波作用能顯著提高GalA的含量，MEP Ⅰ (60.27%)、MEP Ⅱ (58.12%)、UEP Ⅰ(65.96%)和UEP Ⅱ(63.75%)的GalA含量相比酶解果膠(39.57%)分別提高了52.31%、46.88%、66.69%、61.11%。相比于原果膠，幾種降解果膠Rha/GalA明顯降低，GalA/ (Gal+Ara+Rha)顯著提高，說明酶促降解、微波輔助果膠酶降解和超聲波輔助果膠酶降解都能使果膠主鏈和側(cè)鏈發(fā)生不同程度的斷裂。整體上，改性前后柑橘果膠的紅外光譜吸收基團類型未發(fā)生，表明組成果膠的糖類型未變，這與單糖組成分析的結(jié)果一致。傅里葉紅外光譜結(jié)果顯示不同降解處理后的果膠都具有明顯的特征峰，改性果膠的酯化度減小，且改變了果膠的單糖組成。從掃描電鏡圖可以看出果膠酶、微波、超聲都影響了果膠的微觀結(jié)構(gòu)。