段曉燕 都義日 翁兆平 王相成 王春梅 王 濤 李劍波

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 呼和浩特010050）

脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid，DNA）作為遺傳信息的載體，在所有生命系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。然而，在納米領(lǐng)域中，通過納米技術(shù)創(chuàng)造出人工的、多樣的DNA多面體結(jié)構(gòu)在納米技術(shù)、自組裝材料、分子電子技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域同樣發(fā)揮著重要作用［1-5］。

利用DNA分子內(nèi)和分子間Watson-Crick堿基配對(duì)構(gòu)建出可預(yù)測、可編輯的納米結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出具有不同維度、形狀和尺寸的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，如DNA二十面體結(jié)構(gòu)［6］、DNA立方體結(jié)構(gòu)［7］、DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)［8］、DNA四面體結(jié)構(gòu)［9］等。DNA多面體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出優(yōu)異體內(nèi)特性，包括毒性小、免疫原性低和優(yōu)異生物穩(wěn)定性［10］等。尤其在藥物遞送系統(tǒng)中，DNA多面體結(jié)構(gòu)具有更加廣闊前景，具有較長藥物體內(nèi)半衰期、生物利用度高和在特定組織中積累等特性，減少劑量依賴性和副作用。因?yàn)镈NA多面體結(jié)構(gòu)在分子探針、藥物載帶等方面存在著巨大潛力，引起了國內(nèi)外研究人員的關(guān)注［11-15］。

在前期研究中［16］，采用二氯亞錫還原法對(duì)單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA，A20）進(jìn)行99mTc標(biāo)記，得到標(biāo)記ssDNA（99mTc-ssDNA）；再將99mTcssDNA（A20）與含有T20手臂鏈的DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)（DNA Bipyramid Nanostructures，DBNs）混合雜交，得到99mTc-DBNs。通過一系列的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探索了99mTc-DBNs在昆明鼠體內(nèi)的分布和代謝情況。研究結(jié)果顯示DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)具備發(fā)展成為

SPECT（Single-Photon Emission Computed Tomography）分子探針的潛力。锝-99m屬于單光子核素，采用SPECT設(shè)備進(jìn)行信號(hào)采集；而PET設(shè)備采集正電子核素所產(chǎn)生的兩個(gè)背向光子，分辨率更高，圖像更為清楚。所以在本研究中，基于前期99mTc（金屬放射性核素）標(biāo)記DNA單鏈的研究成果，我們選用發(fā)射正電子的放射性金屬核素取代99mTc進(jìn)行DNA單鏈的標(biāo)記研究，而64Cu成為最佳的候選PET核素之一。在制備基于DNA多面體結(jié)構(gòu)的PET分子探針時(shí)，擬采用與制備99mTc-DBNs相似的標(biāo)記方法，即首先將64Cu標(biāo)記ssDNA，得到64Cu-ssDNA；再將64Cu-ssDNA與含有手臂鏈的DNA多面體結(jié)構(gòu)混合雜交，從而制備出64Cu標(biāo)記的DNA多面體結(jié)構(gòu)，所以64Cu標(biāo)記ssDNA的制備就成為制備基于DNA多面體結(jié)構(gòu)的PET分子探針的關(guān)鍵一步。

本文在前期研究基礎(chǔ)和以上實(shí)驗(yàn)設(shè)想上，將探索64Cu標(biāo)記ssDNA的最佳標(biāo)記條件；同時(shí)通過體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)，研究64Cu標(biāo)記ssDNA在昆明鼠體內(nèi)的分布代謝情況，為后續(xù)64Cu標(biāo)記DNA多面體結(jié)構(gòu)PET分子探針的制備及分子探針在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的生物性質(zhì)研究提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)對(duì)照信息。

1 方法與材料

1.1 材料

DNA寡聚核苷酸單鏈（ssDNA）于Takara生物醫(yī) 學(xué) 技 術(shù) 公 司（北 京）；p-SCN-Bn-NOTA于Macrocyclics公司（Plano，TX，USA）；昆明鼠（雌性，4～6周，18～20 g）于內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；其他化學(xué)試劑于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）。

1.2 單鏈DNA的放射性標(biāo)記

在對(duì)單鏈DNA（ssDNA）進(jìn)行64Cu標(biāo)記之前，需要先將ssDNA與螯合劑p-SCN-Bn-NOTA進(jìn)行偶聯(lián)［17］。首先對(duì)ssDNA的5’端進(jìn)行氨基修飾（Takara生物醫(yī)學(xué)技術(shù)公司提供）；然后將一定量的氨基修飾ssDNA溶解于磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）中，制成0.1 mmol·L-1ssDNA溶液；量取0.5 mg p-SCN-Bn-NOTA粉末溶解在DMSO中，加入ssDNA溶液中，碳酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)混合液pH至8.5～9.0。反應(yīng)混合液在室溫下持續(xù)振蕩2 h。反應(yīng) 結(jié) 束 后，利 用NAP-5脫鹽柱（GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT，USA）對(duì)反應(yīng)混合液進(jìn)行純化，1xPBS作為洗脫緩沖液，得到純化的偶聯(lián)NOTA的ssDNA（NOTA-ssDNA）。NOTA-ssDNA的濃度由UV-VIS光譜儀（Agilent Cary 60，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）測量，其中DNA的濃度確定后，用于后續(xù)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

將64Cu溶液（溶于0.1 mol·L-1HCl）與100μL醋酸鈉溶液（0.05 mol·L-1，pH 5.5）混勻，加入500μL NOTA-ssDNA溶液后，在37°C下反應(yīng)1 h。在反應(yīng)期間，利用放射性高效液相色譜（Radio-HPLC）檢測放射性標(biāo)記反應(yīng)的程度。反應(yīng)結(jié)束后，將混合溶液通過NAP-5脫鹽柱純化，乙二胺四乙酸鈉溶液（0.05 mol·L-1）用作流動(dòng)相，得到純化的目標(biāo)產(chǎn)物64Cu標(biāo)記ssDNA（64Cu-ssDNA），用于后續(xù)的生物學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。

1.3 體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將純化后64Cu-ssDNA（100μL）分別與PBS溶液（200μL）和小鼠血清（Mouse serum，200μL）孵育一定時(shí)間，利用薄層色譜（Thin Layer Chromatography，TLC）在不同時(shí)間點(diǎn)（0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、6.0 h）檢測64Cu-ssDNA的放化純度，計(jì)算64Cu-ssDNA的體外穩(wěn)定性。

1.4 體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)

將3.7×106Bq64Cu-ssDNA通過小鼠尾靜脈注射到昆明鼠體內(nèi)，在注射后30 min和180 min后，將昆明鼠（n=3/每組）麻醉后處死，收集感興趣器官或者組織進(jìn)行稱重，并用γ計(jì)數(shù)器（PerkinElmer）測量64Cu-ssDNA的攝取量。每個(gè)器官或組織中的示蹤劑攝取量表示為每克組織注射劑量的百分比（%ID·g-1）。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究方案已經(jīng)得到內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”進(jìn)行［18］。

2 結(jié)果與討論

2.2 單鏈DNA的放射性標(biāo)記及體外穩(wěn)定性

ssDNA的放射性標(biāo)記按照圖1所示進(jìn)行。首先將氨基修飾ssDNA與雙功能螯合劑p-SCN-Bn-NOTA進(jìn)行偶聯(lián)，得到NOTA-ssDNA溶液；再將NOTA-ssDNA溶 液 與64Cu溶 液 混 勻，反 應(yīng)1 h后Radio-HPLC（Dionex UltiMate 3000）檢測，放化標(biāo)記率為（66.4±2.85）%（n=3），如圖2所示。64Cu-ssDNA保留時(shí)間為9～10 min，而游離銅保留時(shí)間在15～16 min；利用NAP-5脫鹽柱對(duì)反應(yīng)溶液進(jìn)行純化，得到64Cu-ssDNA溶液，放化純度大于95%。

圖1 ssDNA放射性標(biāo)記示意圖Fig.1 Schematic diagram of ssDNA radiolabeling

將純化后64Cu-ssDNA分別與PBS溶液（v/v=1/2）和小鼠血清（v/v=1/2）孵育一定時(shí)間，利用TLC檢測64Cu-ssDNA的放化純度，結(jié)果如圖3所示，64CussDNA在PBS和小鼠血清中至少能穩(wěn)定存在6 h，且在小鼠血清中孵育4 h后，64Cu-ssDNA的放化純度大于90%。

圖2 64Cu-ssDNA的放射性HPLC分析Fig.2 Radio-HPLC analysis of 64Cu-ssDNA

圖3 64Cu-ssDNA在PBS溶液和小鼠血清中的穩(wěn)定性研究Fig.3 Stability of 64Cu-ssDNA in PBS and mouse serum

2.3 體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)

將純化后64Cu-ssDNA（3.7×106Bq）溶液通過尾靜脈注射到昆明鼠體內(nèi)，在注射后30 min和180 min，將該時(shí)間點(diǎn)昆明鼠（n=3）麻醉后處死，取感興趣組織或者器官，研究各組織或器官64Cu-ssDNA的攝取量，數(shù)值用%ID·g-1進(jìn)行表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。注射64Cu-ssDNA 30 min后，心臟中放射性攝取量為（3.53±0.30）%ID·g-1，在180 min后，心臟中的攝取量為（2.33±0.36）%ID·g-1，64Cu-ssDNA進(jìn)入血管后，隨著血液循環(huán)運(yùn)送到各個(gè)臟器或器官。注射64Cu-ssDNA 30 min和180 min后，肌肉和腦組織放射性攝取量低，攝取量值均低于1%ID·g-1；注射后30 min，肝臟和脾臟有一定量的放射性攝取，攝取 量 分 別 是（6.99±0.77）% ID·g-1和（3.11±0.42）%ID·g-1，注射后180 min，肝臟和脾臟中的攝取量有些降低，攝取量分別是（5.66±0.89）%ID·g-1和（1.49±0.33）%ID·g-1。胃腸道的放射性攝取量從注射后30 min的（3.64±0.30）%ID·g-1到180 min后的（21.37±4.50）%ID·g-1，說明一部分64Cu-ssDNA通過昆明鼠的胃腸道代謝。注射64Cu-ssDNA 30 min后，腎臟中出現(xiàn)高放射性攝取量（（12.87±1.56）%ID·g-1），說明64Cu-ssDNA通過尾靜脈進(jìn)入昆明鼠體內(nèi)后，經(jīng)過腎臟過濾進(jìn)入膀胱，此時(shí)間點(diǎn)膀胱中的放射性攝取量達(dá)到了（38.36±4.65）%ID·g-1；180 min后，腎臟中的攝取量較30 min時(shí)的攝取量降低，而膀胱中的放射性攝取量進(jìn)一步增大，達(dá)到了（63.84±5.86）%ID·g-1，結(jié)果說明64Cu-ssDNA進(jìn)入昆明鼠體內(nèi)后，主要通過泌尿系統(tǒng)代謝排出體外。

圖4 64Cu-ssDNA在昆明鼠體內(nèi)的分布研究（n=3）Fig.4 Biodistribution of 64Cu-ssDNA in Kunming mice(n=3)

3 結(jié)語

本研究成功對(duì)ssDNA進(jìn)行了銅-64標(biāo)記，得到了目標(biāo)產(chǎn)物64Cu-ssDNA（純化后放化純度＞95%），為后期基于DNA多面體結(jié)構(gòu)的PET分子探針的制備解決了關(guān)鍵的一步；同時(shí)本文也對(duì)64Cu-ssDNA在昆明鼠體內(nèi)的分布代謝情況進(jìn)行了研究，了解64CussDNA進(jìn)入昆明鼠體內(nèi)后，主要通過泌尿系統(tǒng)代謝排出體外，為后續(xù)研究64Cu標(biāo)記DNA多面體結(jié)構(gòu)的體內(nèi)分布代謝提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)對(duì)照。