陳 銘，朱 莉，劉 玲，王如珠，朱俊國(guó)，林 杰

(泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州225300)

心房顫動(dòng)(AF)是心血管類疾病的常見(jiàn)并發(fā)癥，近年來(lái)隨著全球人口老齡化，AF的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者的生存率及生活質(zhì)量[1-2]。AF的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，它受血流動(dòng)力學(xué)、內(nèi)皮損傷、凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)及炎性因子等多因素作用[3-5]。目前研究最為廣泛的是患者心房纖維化導(dǎo)致心房重構(gòu)引發(fā)心房顫動(dòng)[6-7]。本文通過(guò)檢測(cè)與心房纖維化密切相關(guān)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)/Smads信號(hào)通路，探尋誘發(fā)心房顫動(dòng)的發(fā)生機(jī)制，為臨床早期預(yù)防和治療提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇我院2017年12月至2019年4月住院的心房顫動(dòng)患者120例作為實(shí)驗(yàn)組，其中男性52例(平均年齡63.2±4.8歲)、女性68例(平均年齡65.8±6.2歲)，發(fā)病時(shí)間在1個(gè)月以內(nèi)；同期選擇在本院體檢的120例健康人作為對(duì)照組，其中男性61例(平均年齡61.6±5.2歲)、女性59例(平均年齡59.7±3.6歲)。兩組均排除心臟器質(zhì)性損傷、腫瘤、可逆性房顫、肝腎功能不全及重癥炎癥，所有受試者均對(duì)實(shí)驗(yàn)研究知情且自愿簽署知情同意書(shū)。兩組受試者一般資料年齡、性別比較無(wú)差異均具有可比性(P>0.05)。

1.2 方法兩組受試者均清晨空腹采集肘靜脈血5 ml，靜置15 min后3 000 rpm離心10 min，收集血清液氮中保存待測(cè)?？谷私Y(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)/Smads信號(hào)通路酶聯(lián)免疫試劑盒均由北京鼎國(guó)生物有限公司提供；實(shí)時(shí)熒光定量所需試劑Trizol裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司；CTGF、bFGF、HGF、TGF-β1/Smads及GAPDH內(nèi)參引物購(gòu)于上海生物工程有限公司(引物序列見(jiàn)表1)。儀器設(shè)備主要有酶標(biāo)儀Epoch(美國(guó))、 7500/7500Fast Real-timeQuantitative PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó))。

表1 引物序列

兩組受試者血清中CTGF、bFGF、HGF、TGF-β1/Smads的蛋白含量采用雙抗體夾心法，嚴(yán)格遵循試劑盒操作步驟。兩組受試者血清中CTGF、bFGF、HGF、TGF-β1/Smads的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量法，首先Trizol試劑提取總RNA，采用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度；然后取1 μg總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；最后以DNA為模板使用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，采用7500/7500Fast Real-timeQuantitative PCR檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平；用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者血清中CTGF、bFGF、HGF蛋白含量水平的比較與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組患者血清中CTGF、bFGF的蛋白含量水平明顯升高，HGF的蛋白含量水平明顯降低，兩組間比較差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組受試者血清中CTGF、bFGF、HGF蛋白含量水平的比較

1)與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.2 兩組受試者血清中CTGF、bFGF、HGF的mRNA表達(dá)水平的比較與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組患者血清中CTGF、bFGF的mRNA表達(dá)水平明顯升高，HGF的mRNA表達(dá)水平明顯降低，兩組間比較差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組受試者血清中CTGF、bFGF、HGF的mRNA表達(dá)水平的比較

2.3 兩組受試者血清中TGF-β1/Smads信號(hào)通路表達(dá)水平的比較與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組患者血清中TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白含量及mRNA表達(dá)水平均明顯升高，兩組間比較差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 兩組受試者血清中TGF-β1/Smads信號(hào)通路表達(dá)水平的比較

3 討論

近年來(lái)有研究表明心房顫動(dòng)的發(fā)生率與年齡呈正相關(guān)，心房顫動(dòng)顯著增加了老年人的致死和致殘率[8]。房顫引發(fā)血栓、腦卒中及心力衰竭嚴(yán)重影響患者的的生存質(zhì)量及預(yù)后[9]。房顫的發(fā)病機(jī)制主要涉及房顫發(fā)生的基質(zhì)、觸發(fā)機(jī)制、房顫發(fā)生的相關(guān)調(diào)節(jié)因子及心房重構(gòu)等，其中以心房重構(gòu)及相關(guān)調(diào)節(jié)因子的研究較為多見(jiàn)[10]。

心肌纖維化導(dǎo)致心房重構(gòu)是心房顫動(dòng)的病因之一，研究心肌纖維化發(fā)生機(jī)制是有效干預(yù)房顫發(fā)生的關(guān)鍵[11]。以往研究發(fā)現(xiàn)心房重構(gòu)的效應(yīng)細(xì)胞是心肌成纖維細(xì)胞(CFs)，是心臟骨架的重要組成部分，當(dāng)心臟受到病理性刺激時(shí)CFs開(kāi)始增殖進(jìn)而分化為肌成纖維細(xì)胞，然后分泌細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡促進(jìn)心肌組織纖維化，從而引發(fā)心房重構(gòu)導(dǎo)致心房顫動(dòng)[12]。TGF-β/Smads信號(hào)通路是各種原因?qū)е滦募±w維化的共同信號(hào)通路，TGF-β家族有六種亞型，其中TGF-β1是目前公認(rèn)的最強(qiáng)的致纖維化因子，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積具有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用。TGF-β1的下游激活因子是Smad2和Smad3[13]。在某些病理狀態(tài)下，TGF-β1/Smads 信號(hào)通路被激活，進(jìn)而調(diào)控CFs增殖，促進(jìn)其分化為肌纖維細(xì)胞，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，沉積在細(xì)胞周圍，造成心房組織纖維化，最終導(dǎo)致心房重構(gòu)[14]。本研究結(jié)果顯示，心房顫動(dòng)患者血清中TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白含量及mRNA表達(dá)水平顯著升高，與健康對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示患者體內(nèi)TGFβ信號(hào)被激活可能與其房顫的發(fā)生密切相關(guān)。

CFs的增殖及膠原蛋白合成受到許多細(xì)胞因子調(diào)控，主要包括CTGF、bFGF、HGF等。其中CTGF和bFGF是促進(jìn)纖維化發(fā)生的細(xì)胞因子，兩者通過(guò)促進(jìn)CFs分裂增殖，轉(zhuǎn)型為分泌合成膠原能力旺盛的肌成纖維細(xì)胞[15]，分泌大量心肌膠原蛋白沉積于心房間質(zhì)導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化[16]。 而HGF是目前唯一抑制纖維化發(fā)生的細(xì)胞因子[17]，可促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞分泌肝素結(jié)合糖蛋白，抑制肌成纖維細(xì)胞的合成和活化，從而抑制心肌膠原蛋白的合成[18]。本研究結(jié)果顯示，心房顫動(dòng)患者血清中CTGF和bFGF的蛋白含量及mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)、HGF的蛋白含量及mRNA表達(dá)水平顯著減低(P<0.05)。此結(jié)果提示，患者房顫的發(fā)生可能與促進(jìn)心肌間質(zhì)纖維化的CTGF和bFGF的表達(dá)升高，而抑制心肌纖維化的HGF的表達(dá)降低有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，CTGF、bFGF、HGF細(xì)胞因子及TGF-β/Smads信號(hào)通路可能參與了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而導(dǎo)致心房重構(gòu)進(jìn)而引發(fā)心房顫動(dòng)，且在心房顫動(dòng)早期就出現(xiàn)明顯的改變，因此深入研究CTGF、bFGF、HGF細(xì)胞因子和TGF-β/Smads信號(hào)通路有助于揭示和探尋誘發(fā)心肌纖維化及心房顫動(dòng)的血清學(xué)標(biāo)記物，為臨床早期預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)、指導(dǎo)意義及新靶點(diǎn)。