張可欣，楊思熙,王麗娜，劉金霞，邢恩鴻

(1.承德醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 承德067000;2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 婦科，河北 承德067000)

乳頭瘤病毒(HPV)是一種乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒，目前已發(fā)現(xiàn)140余種亞型[1]。不同亞型的 HPV感染所導(dǎo)致的后果也不同，低危型主要可導(dǎo)致尋常疣和良性病變，而高危型主要可導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤病變或者是宮頸癌[2]，最新研究表示， HPV感染也與動(dòng)脈粥樣硬化和口咽癌的形成有關(guān)[3-4]。因此，早期識別HPV感染，對預(yù)防可能發(fā)生的疾病有著重要的指導(dǎo)作用。

目前，臨床上對于 HPV的診斷手段主要以斑點(diǎn)雜交或原位雜交為主[5-6]，這種方法需要配套的昂貴設(shè)備才能完成，不適用于基層醫(yī)院或社區(qū)現(xiàn)場進(jìn)行 HPV的篩查和分型。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是在2000年由日本學(xué)者 Notomi開發(fā)的一項(xiàng)適用于基因診斷的技術(shù)[7]，具有特異性強(qiáng)、結(jié)果可用肉眼判定、無需特殊裝置的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將基于該技術(shù)對HPV16、18、52、58亞型臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測并分型，旨在探討LAMP在臨床的使用前景。

1 材料與方法

1.1 試劑

Bst DNA聚合酶和10X reaction buffer購自美國NEB公司，鈣黃綠素購自Sigma公司，100 bp DNA Marker購自TaKaRa公司，PCR Mix購自TIANGEN公司。

1.2 標(biāo)本采集

收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2018年8月-2018年10月部分就診患者宮頸脫落細(xì)胞懸液共155例，其中4例經(jīng)該院檢驗(yàn)科使用潮州凱普公司HPV分型試劑盒檢測后HPV16、18、52、58感染，其余151例未知亞型。

1.3 DNA模板制備

DNA模板制備將標(biāo)本混合均勻后，15 000 r/min離心5 min，棄上清，留沉淀，加入50 μl核酸裂解液，100℃煮沸5 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 LAMP特異性引物

根據(jù)GenBank公布的HPV16亞型(GenBank登錄號： EU869318.1)、18亞型(GenBank登錄號： KY457840.1)、52亞型(GenBank登錄號： EU924144.1)和58亞型(GenBank登錄號： KU298920.1) E6、 E7區(qū)域?yàn)閰⒖夹蛄校瑧?yīng)用 Clustal Omega軟件進(jìn)行序列對比，選取其保守區(qū)域，用 LAMP專用引物設(shè)計(jì)軟件(Primer Explorer V5)設(shè)計(jì)每種亞型的4條引物，引物序列見表1，其中 F3和 B3為外部引物，F(xiàn)IP和 BIP是內(nèi)部引物，所有引物均委托上海生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

表1 HPV病毒的LAMP引物序列表

1.5 臨床標(biāo)本的檢測

分別應(yīng)用LAMP和PCR兩種檢測方法對155例臨床標(biāo)本逐個(gè)檢驗(yàn)。 LAMP體系根據(jù)前期體系優(yōu)化結(jié)果，分別采用以下體系配置反應(yīng)液(表2)，65℃水浴1 h后，置冰上停止反應(yīng)，觀察可視化結(jié)果，黃色提示陰性，綠色提示陽性。 PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)以LAMP外引物(F3/B3)為上、下游引物。 采用25 μl體系：12.5 μl PCR Mix，1 μl F3/B3，1 μl DNA模板，其余用ddH2O補(bǔ)足。 擴(kuò)增條件： 94℃ 3 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。 結(jié)果判斷：取5 μl產(chǎn)物，采用2% 濃度的瓊脂糖凝膠開展電泳實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，在凝膠成像儀下觀察電泳條帶。

表2 LAMP 反應(yīng)體系

1.6 LAMP特異性檢測

通過互換模板實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 LAMP的特異性，分別以 HPV16、18、52、58亞型 DNA及雙蒸水為模板，應(yīng)用4套特異性引物進(jìn)行 LAMP擴(kuò)增，根據(jù)瓊脂糖電泳結(jié)果和染色結(jié)果判斷引物特異性，每種亞型的特異性檢測重復(fù)4次以上。

1.7 LAMP和PCR靈敏度檢測

對經(jīng)熒光定量 PCR檢測后所含菌量約為2×106IU/μ L的 HPV DNA進(jìn)行梯度稀釋，對最終拷貝數(shù)分別為104、103、100、10 IU/μ L的模板，分別進(jìn)行 LAMP和 PCR擴(kuò)增，并通過 LAMP可視化結(jié)果及2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行靈敏度分析，對 LAMP的靈敏度檢測重復(fù)4次以上。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS21.0軟件比較LAMP和PCR對155例標(biāo)本檢測結(jié)果的一致性。Kappa值為0.4-0.7時(shí)一致性一般，>0.7時(shí)一致性好。

2 結(jié)果

2.1 特異性實(shí)驗(yàn)

分別對HPV四種亞型進(jìn)行模板互換擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)后，瓊脂糖電泳結(jié)果如圖1A、C所示，其中16、18、52、58所囊括的泳道分別代表使用該亞型引物進(jìn)行擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖，泳道16、18、52、58分別對應(yīng) HPV四種亞型模板。由圖可知，每種亞型的特異性引物僅可擴(kuò)增該亞型模板，其余模板及陰性對照均未被擴(kuò)增，表示本文中建立的 LAMP體系特異性較好，不受其他模板的擾亂。

鈣黃綠素染色效果如圖1 B、D所示，各管按排列順序同上，經(jīng)比較可得兩種檢測產(chǎn)物方法結(jié)果一致，可通過簡單的肉眼觀察代替電泳檢測。4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與以上結(jié)果相當(dāng)。

圖1 LAMP檢測HPV的特異性

2.2 靈敏度實(shí)驗(yàn)

分別應(yīng)用PCR和LAMP對一系列梯度稀釋后的HPV DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。圖2A表示HPV16亞型的LAMP檢測限為100IU/ μl，HPV18的LAMP檢測限為103IU/μL；圖2D表示HPV52亞型的LAMP檢測限為100IU/μL，HPV58亞型的LAMP檢測限為103IU/μL； 圖2C、F表示HPV16、18、52、58亞型的PCR檢測限均為103IU/μL。由此可知LAMP對HPV16、52亞型的檢測限均比PCR高一個(gè)數(shù)量級。

圖2B、E表示鈣黃綠素的可視化結(jié)果，綠色表示陽性、黃色表示陰性，排列順序同上，與電泳結(jié)果對比后可知其染色效果與電泳結(jié)果相當(dāng)。4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，均與以上結(jié)果相當(dāng)。

圖2 LAMP和PCR的靈敏度檢測

表3 LAMP的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.3 臨床標(biāo)本檢測

LAMP擴(kuò)增105例經(jīng) PCR檢測為陽性的標(biāo)本和50例陰性標(biāo)本后，將兩種分型結(jié)果進(jìn)行一致性比較，結(jié)果如表4所示。在105例經(jīng)PCR確認(rèn)為陽性的標(biāo)本中，LAMP檢測出99例，靈敏度為94.29%。在50例經(jīng)PCR確認(rèn)為陰性的標(biāo)本中，LAMP檢測出46例，特異性為92.0%。應(yīng)用SPSS對其進(jìn)行一致性檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)后得出， LAMP與 PCR檢測有極好的一致性(Kappa值=0.854)。

表4 LAMP和PCR的一致性比較

3 討論

宮頸癌作為世界女性最多見的惡性腫瘤之一，一直受到較大重視。近年來，經(jīng)研究證實(shí)，高危型 HPV的反復(fù)持續(xù)感染與其產(chǎn)生息息相關(guān)[8]，且不同亞型 HPV所導(dǎo)致的結(jié)果也不盡相同[9]。因此，早期識別HPV感染并對其進(jìn)行分型檢查是防治宮頸癌的必要基礎(chǔ)[10]。目前國內(nèi)醫(yī)院針對HPV的檢測及分型普遍為斑點(diǎn)雜交或原位雜交[11-13]，但需要大型儀器和昂貴的設(shè)備，不適合基層或現(xiàn)場檢測。因此臨床上正亟待一種更為方便、簡單的診斷方法用來補(bǔ)充甚至替代原有的HPV診斷方法。

本文中所使用的 LAMP技術(shù)是在2000年由日本學(xué)者 Notomi公布的一項(xiàng)可在恒溫狀態(tài)下進(jìn)行擴(kuò)增的基因診斷技術(shù)，是一種快速、便攜、低成本的檢測方法，現(xiàn)已廣泛用于疾病檢測方面[14-16]，本研究在原有的 LAMP技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些改良，主要改良方面總結(jié)如下： 1)模板提取的改良。由于Bst酶的抗干擾能力比較好，因此可以將收集的臨床標(biāo)本直接煮沸進(jìn)行核酸的粗提，省去繁雜的核酸純化過程，使核酸提取步驟大大簡化。2)結(jié)果判定的改良。LAMP的結(jié)果判定常用濁度法，該方法單用肉眼難以判定結(jié)果，需要用濁度儀檢測才能確定擴(kuò)增結(jié)果，判斷起來比較不便。本研究在擴(kuò)增反應(yīng)開始前向體系中加入鈣黃綠素，利用其顏色改變進(jìn)行結(jié)果判定，使其即不抑制擴(kuò)增，又可使結(jié)果可視化，使結(jié)果判定更加簡單。

本文中建立的 LAMP體系為 HPV的分型檢測提供了初步探索經(jīng)驗(yàn)，如果能在此基礎(chǔ)上對該技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步改良，如制作基于 LAMP技術(shù)的便攜式核酸擴(kuò)增檢測儀或開發(fā)一步法封閉式檢測管，必將更有利于應(yīng)用 LAMP技術(shù)在基層或現(xiàn)場進(jìn)行檢測。