張 玉，顧芹英，翟燕娟，李 松，張?jiān)铺?/p>

(江陰天江藥業(yè)有限公司研究院，江蘇 江陰 214434)

合歡花為豆科植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥花絮或花蕾，我國(guó)的合歡花資源較為豐富，主產(chǎn)于河北省、河南省、陜西省、浙江省和江蘇省等地；合歡花性平，味甘，歸心、脾經(jīng)，具有解郁安神之功效。文獻(xiàn)報(bào)道[1-3]，其所含化學(xué)成分種類(lèi)廣泛，包括黃酮類(lèi)、三萜及其皂苷類(lèi)、生物堿類(lèi)、有機(jī)酸、甾醇、木脂素和單寧類(lèi)，其中對(duì)黃酮類(lèi)和三萜及其皂苷類(lèi)的研究最為廣泛。目前，缺乏有關(guān)合歡花藥材超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)特征圖譜和UPLC串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-tandem quadrupole-time of flight mass spectrometry，UPLC-Q/TOF-MS)物質(zhì)基礎(chǔ)方面的研究[4]?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明，合歡花水煎液可改善抑郁模型小鼠的抑郁癥狀，可提高抑郁小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其所含的黃酮類(lèi)物質(zhì)可能是其發(fā)揮抗抑郁作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，此外還有鎮(zhèn)靜催眠、抑菌、抗肥胖及調(diào)節(jié)腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)等作用[5-6]。

目前，UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)已成為復(fù)雜基質(zhì)中多成分的有效、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)手段，相對(duì)于傳統(tǒng)的高效液相色譜法，UPLC的分離效果更好，分析速度更快，而Q/TOF分辨率高、靈敏度高，能夠?qū)崿F(xiàn)分子量的精確測(cè)定，非常適合復(fù)雜基質(zhì)中組分的檢測(cè)定性[7-8]。查閱相關(guān)資料，暫時(shí)缺乏有關(guān)合歡花中化學(xué)成分的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究。本研究開(kāi)展了合歡花藥材UPLC特征圖譜研究并借助UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)定性分析了合歡花藥材中的化學(xué)成分，該操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可為后續(xù)合歡花的質(zhì)量控制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)和提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC型超高效液相色譜儀(Waters公司)；Empower 3工作站(Waters公司)；安捷倫1290型超高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；安捷倫6530四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源(美國(guó)安捷倫公司)；MassHunter Data Acquisition采集工作站，MassHunter Qualiative Analysis分析工作站(美國(guó)安捷倫公司)；十萬(wàn)分之一型和百萬(wàn)分之一型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；KQ-250B型超聲清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；控溫水浴鍋(南通華泰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；純水系統(tǒng)(Sartorius公司)；AS165 W型離心機(jī)[亞速旺(上海)商貿(mào)有限公司]。

1.2 藥品與試劑

乙腈(色譜純，Thermo Fisher公司)；水為屈臣氏蒸餾水；磷酸(色譜純，Aladdin公司)；甲酸(色譜級(jí)，Sigma公司)；金絲桃苷對(duì)照品、異槲皮苷對(duì)照品及槲皮苷對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，編號(hào)分別為111521-201406、111809-201403及180109-02AB；L-色氨酸對(duì)照品、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷對(duì)照品購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司，編號(hào)分別為6135、6455。合歡花藥材由江陰天江藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)江陰天江藥業(yè)有限公司研究院唐波研究員鑒定為豆科植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥花絮或花蕾。

2 方法與結(jié)果

2.1 特征圖譜

2.1.1 色譜條件：色譜柱為CORTECS UPLC T3柱(Waters, 2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，以0.1%甲酸-水為流動(dòng)相A、以乙腈為流動(dòng)相B，柱溫為35 ℃，流速為0.30 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，進(jìn)樣量為1 μl。梯度洗脫條件如下：0～4 min(92%→85%A)，4～7 min(85%→77%A)，7～10 min(77%→74%A)，10～14 min(74%→40%A)，14～16 min(40%A)，16～16.1 min(40%→92%A)。

2.1.2 溶液的制備：(1)對(duì)照品溶液制備。取槲皮苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 ml含槲皮苷50 μg的溶液，即得。取L-色氨酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于棕色容量瓶中，加水制成含10 μg/ml的溶液，即得。分別取金絲桃苷對(duì)照品、異槲皮苷對(duì)照品和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于棕色容量瓶中，加70%甲醇分別制成含100、20和70 μg/ml的溶液，即得。(2)供試品溶液制備。取本品中粉約0.2 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 ml，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察：(1)精密度。取同一批號(hào)樣品，按“2.1.2(2)”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，1次1 μl，以槲皮苷所對(duì)應(yīng)的峰為參照峰(S峰)，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.29%～1.13%，各共有峰的相對(duì)峰面積的RSD為0.03%～0.14%，RSD均<2.0%，表明儀器精密度良好。(2)穩(wěn)定性。取同一批號(hào)樣品，按“2.1.2(2)”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣1次，1次1 μl，共測(cè)定12 h，以槲皮苷所對(duì)應(yīng)的峰為參照峰(S峰)，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.04%～1.05%，各共有峰的相對(duì)峰面積的RSD為0.42%～1.54%，RSD均<2.0%，表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。(3)重復(fù)性。取同一批號(hào)樣品，按“2.1.2(2)”項(xiàng)下供試品溶液制備方法分別制成6份供試品溶液，各進(jìn)樣1次，1次1 μl，以槲皮苷所對(duì)應(yīng)的峰為參照峰(S峰)，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.20%～1.05%，各共有峰的相對(duì)峰面積的RSD為0.05%～1.28%，RSD均<2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 特征圖譜建立和共有峰指認(rèn)：(1)特征圖譜建立。取17批各個(gè)產(chǎn)地合歡花藥材適量，分別按照“2.1.2(2)”項(xiàng)下制成供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)》進(jìn)行分析、比較，經(jīng)多點(diǎn)校正和自動(dòng)匹配后，生成對(duì)照特征圖譜，以槲皮苷為參照峰(S峰)，共標(biāo)定5個(gè)共有峰，建立合歡花藥材UPLC特征圖譜。其他4個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.38、0.87、0.89及1.14，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.06%～1.73%，RSD均<2.0%，見(jiàn)圖1。(2)各共有峰的指認(rèn)。取各對(duì)照品溶液、合歡花藥材適量，按照“2.1.2(2)”項(xiàng)下制成供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果峰1、峰2、峰3、峰4及峰5分別為L(zhǎng)-色氨酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷及山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷，見(jiàn)圖2。

2.2 液質(zhì)聯(lián)用定性分析

2.2.1 色譜條件：色譜柱為CORTECS UPLC T3柱(Waters, 2.1 mm×100 mm,1.6 μm)，以0.1%甲酸-水為流動(dòng)相A、以乙腈為流動(dòng)相B，柱溫為35 ℃，流速為每0.30 ml/min，進(jìn)樣量為2 μl。梯度洗脫條件如下：0～4 min(92%→85%A)，4～7 min(85%→77%A)，7～10 min(77%→74%A)，10～14 min(74%→40%A)，14～16 min(40%A)，16～16.1 min(40%→92%A)。

2.2.2 質(zhì)譜條件：離子源為雙噴ESI離子源，干燥氣溫度300 ℃，流量8 L/min，霧化器壓力 35 psi；負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓3 500 V，正離子模式下毛細(xì)管電壓4 000 V，毛細(xì)管出口電壓120 V，錐孔電壓65 V，碰撞能量10 eV；采用高分辨模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，質(zhì)荷比采集范圍m/z 100～3 000，采樣速度1 spectra/s，采樣時(shí)間1 000 ms/spectra；負(fù)離子采用TFANH4(112.985 587)和HP-0921(1 033.988 109)進(jìn)行質(zhì)量數(shù)實(shí)時(shí)校準(zhǔn)，正離子采用嘌呤(121.050 873)和HP-0921(922.009 798)進(jìn)行質(zhì)量數(shù)實(shí)時(shí)校準(zhǔn)，霧化壓力5 psi。

圖1 合歡花藥材UPLC特征圖譜

A.L-色氨酸；B.金絲桃苷；C.異槲皮苷；D.槲皮苷；E.山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷；F.合歡花藥材；G.空白對(duì)照A.L-tryptophan; B.hyperin; C.isoquercitrin; D.quercetin; E.kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside; F.albizia flower; G.blank control

2.2.3 合歡花中化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的建立：根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)有關(guān)合歡花中化學(xué)成分的研究報(bào)道，收集和整理合歡花中30個(gè)化學(xué)成分，采用安捷倫“formula-database generator”軟件，計(jì)算精確相對(duì)分子量，建立包括化合物名稱(chēng)、分子式、分子量和CAS號(hào)等在內(nèi)的目標(biāo)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

2.2.4 樣品的總離子流圖(TIC)：采用“2.2.1”“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)下的優(yōu)化條件，采集正負(fù)離子模式下的圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖3。

A.樣品ESI+；B.樣品ESI-A. ESI+ sample; B. ESI- sample

2.2.5 化合物的鑒別過(guò)程：以峰11槲皮苷、峰14山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷為例，說(shuō)明合歡花中色譜峰的鑒別過(guò)程。峰11的保留時(shí)間為9.73 min，m/z 449.108 7[M+H]+為其準(zhǔn)分子離子峰，利用Qualitative Analysis數(shù)據(jù)分析軟件的calculator功能計(jì)算精確質(zhì)量數(shù)的可能元素組成，設(shè)定誤差<5 ppm，并比對(duì)已建立的數(shù)據(jù)庫(kù)中已知化合物的質(zhì)荷比，確定元素組成為C21H20O11。計(jì)算C21H20O11的同位素分布情況，與實(shí)際情況相比對(duì)，同位素分布的理論值與實(shí)際值吻合良好，結(jié)合文獻(xiàn)[9]推測(cè)該峰為槲皮苷，主要的二級(jí)特征性的碎片離子m/z 303.050 9為結(jié)構(gòu)中苷鍵斷裂丟失1個(gè)鼠李糖基(C6H10O4)而形成，見(jiàn)圖4。同理，依照上述鑒別過(guò)程，峰14的最終確定的元素組成均為C20H20O10，結(jié)合文獻(xiàn)[10]報(bào)道推測(cè)為山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷，主要的二級(jí)特征性的碎片離子m/z 287.055 6為結(jié)構(gòu)中苷鍵斷裂丟失1個(gè)鼠李糖基(C6H10O4)而形成，見(jiàn)圖5。

A.峰11的精確質(zhì)量及同位素圖；B.峰11的碎片質(zhì)譜圖；C.峰11可能的裂解圖示A. accurate mass and isotopic map of peak 11; B.fragment mass spectrum of peak 11; C.possible splitting decomposition graph of peak 11

2.2.6 鑒別結(jié)果：依據(jù)Q-TOF-MS測(cè)得的高分辨的精確分子量，比對(duì)所建的數(shù)據(jù)庫(kù)，借助Qualiative Analysis離線分析軟件計(jì)算分子式，將理論值與實(shí)際值比對(duì)，結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)，共鑒定出17個(gè)化合物，其中游離氨基酸類(lèi)2個(gè)，有機(jī)酸類(lèi)1個(gè)，黃酮及苷類(lèi)12個(gè)，三萜皂苷類(lèi)1個(gè)，見(jiàn)表1。

3 討論

特征圖譜實(shí)驗(yàn)考察了水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、30%乙醇及稀乙醇等不同的提取溶劑，水提液的色譜峰較少，結(jié)合各提取溶劑的特區(qū)峰形和提取效率，選擇70%甲醇作為提取溶劑?？疾炝顺曁崛　⒓訜峄亓骱驼駬u提取三種不同的提取方式，結(jié)果表明，提取方式的不同對(duì)合歡花的影響不大，采用超聲處理時(shí)，合歡花的提取率微高于其他提取方式，綜合考慮，采用超聲處理作為最終的提取方式。同時(shí)考察了15、30、45和60 min四個(gè)不同提取時(shí)間，結(jié)果表明，各提取時(shí)間所得色譜峰的數(shù)目一致，超聲提取15、30 min的提取率較高，為保證提取充分，最終選擇超聲提取時(shí)間為30 min。對(duì)于流動(dòng)相體系，考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸及乙腈-0.1%醋酸系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)基線漂移嚴(yán)重、色譜峰數(shù)目少，乙腈-0.1%磷酸體系基線平穩(wěn)、峰數(shù)目和容量高，故選取乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相。

A.峰14的精確質(zhì)量及同位素圖；B.峰14的碎片質(zhì)譜圖；C.峰14可能的裂解圖示A.accurate mass and isotopic map of peak 14; B.fragment mass spectra of peak 14; C.possible splitting decomposition graph of peak 14

表1 合歡花藥材UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)分析結(jié)果

液質(zhì)聯(lián)用定性分析實(shí)驗(yàn)考察了50%甲醇、70%甲醇、甲醇及水作為不同的提取溶劑，結(jié)果表明，70%甲醇提取色譜峰容量高于其他提取溶劑。考察了超聲提取、加熱水浴回流提取兩種方法，結(jié)果表明，超聲提取簡(jiǎn)單易操作，且提取效率略高于水浴回流。同時(shí)，考察了15、30、45和60 min四個(gè)不同提取時(shí)間，結(jié)果表明，30 min提取時(shí)間的峰強(qiáng)度和峰容量?jī)?yōu)于其他提取時(shí)間。對(duì)于流動(dòng)相體系，考察了乙腈-水、甲醇-水及乙腈-0.1%甲酸系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)基線漂移嚴(yán)重，干擾大，加了0.1%甲酸的乙腈-水體系后，峰強(qiáng)度明顯提高，峰數(shù)目和容量高于乙腈-水體系，故選取乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相。對(duì)于質(zhì)譜條件中的碰撞能量(CE)，考察了10、15和25 eV三種不同的能量，結(jié)果顯示，10 eV下能夠明顯得觀察準(zhǔn)分子離子峰，符合電噴霧這類(lèi)軟電離質(zhì)譜的溫和的碰撞效果，大多數(shù)化合物在正離子模式下有較好的響應(yīng)，故實(shí)驗(yàn)選取正離子模式進(jìn)行最大限度的獲取質(zhì)譜信息。

合歡花在鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、抗菌等方面有獨(dú)特的藥理活性[16-19]，相關(guān)的藥材質(zhì)量控制研究主要針對(duì)槲皮苷、異槲皮苷等1～3種黃酮類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定[13]。我國(guó)合歡花資源較為豐富，單一的指標(biāo)成分不能很好地控制藥材質(zhì)量，且有關(guān)合歡花全成分的物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少，因此，有必要豐富藥材的質(zhì)量控制手段，對(duì)其成分進(jìn)行系統(tǒng)研究。本研究建立了合歡花藥材UPLC特征圖譜來(lái)控制整體質(zhì)量，方法學(xué)驗(yàn)證了精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性等；并運(yùn)用UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)對(duì)合歡花藥材進(jìn)行快速分析，共鑒定出17個(gè)化合物，其中游離氨基酸類(lèi)2個(gè)，有機(jī)酸類(lèi)1個(gè)，黃酮及苷類(lèi)12個(gè)，三萜皂苷類(lèi)1個(gè)。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，可大大縮短天然產(chǎn)物成分分析的研究周期，節(jié)約成本，可作為合歡花質(zhì)量控制的方法之一，同時(shí)為合理開(kāi)發(fā)合歡花奠定了一定的基礎(chǔ)。