楊 亞， 閆鳳祎， 王 卉， 張克勤

(1. 常熟理工學(xué)院 紡織服裝與設(shè)計(jì)學(xué)院， 江蘇 常熟 215500；2. 蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院， 江蘇 蘇州 215000)

在人體內(nèi)，骨組織展現(xiàn)出了優(yōu)異的力學(xué)性能，其主要由硬而脆的納米級鈣磷鹽和柔軟堅(jiān)韌的有機(jī)蛋白質(zhì)復(fù)合而成。從自然界中得到啟發(fā)，構(gòu)筑具有不同化學(xué)組分的納微米多級結(jié)構(gòu)是組織工程應(yīng)用中先進(jìn)生物材料合成的關(guān)鍵因素。磷酸八鈣(OCP)和絲素蛋白(SF)由于各自具有優(yōu)異的理化性質(zhì)和生物性能，被認(rèn)為是合適的骨組織替代材料[1-3]。

近年來，關(guān)于材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)吸附和細(xì)胞行為影響的研究吸引了眾多關(guān)注，相關(guān)研究表明，生物材料表面納米尺度和微米尺度的結(jié)構(gòu)在一定程度上可直接和間接影響細(xì)胞的生長行為[4-5]。一般來說，如果植入物被植入活體中，蛋白質(zhì)包括許多生物活性物質(zhì)會(huì)立即與這些植入物相互作用并吸附在其表面，這種蛋白質(zhì)吸附過程的研究對于預(yù)測生物進(jìn)程中細(xì)胞對基底的響應(yīng)是至關(guān)重要的[6-7]。眾多研究者指出，生物材料表面微觀結(jié)構(gòu)只有在細(xì)胞粘附蛋白存在的前提下才能促進(jìn)細(xì)胞的粘附，表明蛋白質(zhì)在調(diào)控移植生物材料表面一系列細(xì)胞行為方面起到了重要的作用[8-9]。相關(guān)研究表明，納米材料的特異性可促進(jìn)組織替代材料生物性能和力學(xué)性能的提高[10-12]。

本文利用電化學(xué)沉積技術(shù)精確調(diào)控納微米多級結(jié)構(gòu)，探索材料表面理化特征與其力學(xué)性能和生物性能的相互關(guān)系。在電化學(xué)沉積過程中，通過調(diào)節(jié)SF的質(zhì)量濃度，精確調(diào)控SF/OCP復(fù)合涂層的孔隙尺寸和晶帶寬度；討論納米多級結(jié)構(gòu)表面形貌的變化對牛血清白蛋白(BSA)和纖連蛋白(Fn)吸附以及細(xì)胞活力的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

材料：四水硝酸鈣(分析純)、磷酸二氫銨(分析純)、二甲基亞砜(DMSO)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蠶繭，市售；鈦片(Ti)，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；微量二喹啉甲酸(μBCA)蛋白定量分析試劑盒，安諾倫北京生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，卡邁舒上海生物科技有限公司；纖連蛋白(Fn)， 美國R&D Systems 公司；噻唑藍(lán)(MTT)，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

設(shè)備：CHI600E型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；S-4800型高分辨場發(fā)射掃描電鏡(SEM，日本Hitachi公司)；Synergy 4型酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；G200型納米壓痕儀(美國KLA公司)。

1.2 試樣制備方法

1.2.1 絲素蛋白溶液的制備

將蠶繭剪成合適大小的繭片，稱取一定量放入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Na2CO3溶液中，沸煮45 min后，用去離子水沖洗脫膠絲4～5次，然后自然晾干。將干燥后的絲素撕扯至蓬松狀態(tài)，放入到濃度為9.3 mol/L 的溴化鋰(LiBr)溶液中，在60 ℃下溶解1 h， 用4層紗布過濾溶液中的雜質(zhì)，用透析袋(截留分子量 6 000～8 000) 對溶液進(jìn)行透析處理，透析時(shí)間為3 d，按常規(guī)操作進(jìn)行換水處理，去除溶液中的溴化鋰，最后將透析好的絲素蛋白溶液存放在 4 ℃ 冰箱中備用。

1.2.2 涂層材料制備

采用超純水配制電解液，配制好的電解液中含0.045 mol/L的四水硝酸鈣和0.027 mol/L的磷酸二氫銨，用于制備純OCP涂層。在上述電解液中緩慢添加一定質(zhì)量濃度的SF(0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2.0 mg/mL)，并混合均勻，用于制備SF/OCP復(fù)合涂層。采用CHI600E電化學(xué)工作站，鈦片作為工作電極(陰極)，鉑電極作為對電極(陽極)，飽和甘汞電極作為參比電極，采用恒電流模式進(jìn)行電化學(xué)沉積?？刂齐娏髅芏葹?.2～1.5 mA/cm2，沉積時(shí)間為15 min，沉積溫度為75 ℃。在鈦基底上沉積純OCP涂層和SF/OCP復(fù)合涂層。電化學(xué)沉積結(jié)束后，用超純水對樣品進(jìn)行沖洗，然后晾干備用。

1.3 測試方法

1.3.1 涂層表面孔洞直徑和晶帶寬度測試

通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察涂層表面的形貌特征，打開Image J軟件的長度測量工具，測試電鏡圖像上的孔洞直徑和晶帶寬度并記錄。每種樣品分別測試10組，計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.2 涂層的力學(xué)性能測試

使用納米壓痕儀對純OCP涂層和SF/OCP復(fù)合涂層(1.0 mg/mL)的力學(xué)性能進(jìn)行測試，分析 2種涂層的彈性模量和硬度差異。每種樣品測試 4組， 計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.3 涂層表面蛋白質(zhì)吸附性能測試

使用微量二喹啉甲酸(μBCA)蛋白質(zhì)試劑盒檢測樣品上蛋白質(zhì)吸附的數(shù)量。測試步驟為：將制備好的樣品分別放置在24孔培養(yǎng)板中，每孔分別加入配制好的5 mg/mL BSA/PBS(磷酸鹽緩沖溶液)蛋白質(zhì)溶液1 mL。然后將培養(yǎng)板放置在37 ℃孵化箱中孵化4 h，取出樣品用PBS清洗3次。將清洗過的樣品放置在新的24孔培養(yǎng)板中，每孔加入0.5 mL 體積分?jǐn)?shù)為 5%的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液，然后將培養(yǎng)板放置在37 ℃恒溫振蕩器中，振蕩20 min 以釋放樣品表面吸附的BSA蛋白質(zhì)，最后將溶液收集到新的24孔培養(yǎng)板中，使用μBCA試劑盒測試樣品表面BSA蛋白質(zhì)的吸附量。涂層表面Fn吸附量的測試步驟同上，每孔添加30 μg/mL Fn/PBS蛋白質(zhì)溶液1 mL進(jìn)行測試。

1.3.4 涂層表面細(xì)胞活力測試

使用人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞HUMSCs進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，接種密度為1×105個(gè)/cm2，培養(yǎng)時(shí)間為1、3和7 d。涂層表面細(xì)胞活力測試采用MTT比色實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，依檢測原理，在一定波長下通過測定其吸光度值可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。MTT溶液配制過程為：稱取250 mg MTT粉末放入燒杯中，加入50 mL PBS(0.01 mol/L, pH值為7.4)溶液，在磁力攪拌機(jī)上避光攪拌30 min，配制好的溶液用微孔濾膜除菌處理，放置在4 ℃冰箱保存。將待測樣品放入到24孔培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL MTT溶液，然后放置在培養(yǎng)箱中孵化4 h，將孵化后的樣品轉(zhuǎn)移到新的 24孔板中，每個(gè)樣品中加入400 μL DMSO，搖晃一下放置10 min。最后將每個(gè)樣品孔的溶液分裝到96孔板中，每孔100 μL溶液，每個(gè)樣品分裝3個(gè)孔，用酶標(biāo)儀進(jìn)行測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 涂層表面形貌分析

圖1為純OCP涂層和SF/OCP復(fù)合涂層電鏡(SEM)照片，圖2為其放大的電鏡照片?？梢钥闯?，在電化學(xué)沉積過程中，由于陰極表面氫氣泡的產(chǎn)生，在所有制備的涂層表面都形成了均一的三維多孔結(jié)構(gòu)，當(dāng)一定量的絲素蛋白溶液加入到電解液中時(shí)，鈦(Ti) 基底表面就會(huì)形成具有納微米多級結(jié)構(gòu)的涂層，隨著電解液中絲素蛋白質(zhì)量濃度的增加，涂層表面孔洞直徑和OCP晶體寬度逐漸減小，當(dāng)絲素蛋白質(zhì)量濃度高于1.0 mg/mL時(shí)趨于穩(wěn)定。

圖1 純OCP涂層和SF/OCP復(fù)合涂層電鏡照片F(xiàn)ig.1 SEM images of pure OCP coating and SF/OCP composite coatings

圖2 放大的純OCP涂層和SF/OCP復(fù)合涂層電鏡照片F(xiàn)ig.2 Enlarged SEM images of pure OCP coating and SF/OCP composite coatings

圖3示出涂層孔洞直徑和OCP晶帶寬度隨絲素蛋白添加量的變化?？梢钥闯觯杭僌CP涂層的孔洞直徑為(19.96±6.96)μm，晶帶寬度為(554.33±108.55) nm；隨著電解液中絲素蛋白的加入，孔洞直徑減小到(1.56±0.22) μm，OCP晶帶寬度減小到納米((26.84 ±8.2) nm)級別。

圖3 孔洞直徑和OCP晶帶寬度隨絲素蛋白質(zhì)量濃度的變化Fig.3 Change of pore size (a) and OCP crystals width (b) in prepared coatings with SF concentration

圖4示出SF/OCP復(fù)合涂層電化學(xué)沉積機(jī)制示意圖。在電化學(xué)沉積過程中，當(dāng)絲素蛋白加入到電解液中時(shí)，在陰極/溶液界面的pH值高于電解液 pH值的情況下，SF和OCP共沉積在陰極表面形成納微米多級結(jié)構(gòu)。通過調(diào)控初始電解液中絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度，可以非常容易地控制SF/OCP復(fù)合涂層的微觀形貌。在這個(gè)過程中，絲素蛋白不僅在微米級孔狀結(jié)構(gòu)的形成方面起到了重要作用，而且在納米級纖維狀OCP微晶的形成上也起到了關(guān)鍵作用。當(dāng)電流通過電極時(shí)，由于水解電化學(xué)反應(yīng)，在陰極表面產(chǎn)生大量動(dòng)態(tài)的氫氣泡，如果OCP晶體生長速率與電極表面氫氣泡的形成-離開速率相匹配，OCP晶體可圍繞氫氣泡生長，并沉積在氣泡周圍。這個(gè)過程中，氫氣泡扮演著形成孔狀結(jié)構(gòu)的軟模板。當(dāng)電解液中加入絲素蛋白后，SF很可能吸附在暴露于溶液中的(100)晶面上，從而抑制OCP晶體的生長。

圖4 SF/OCP復(fù)合涂層電化學(xué)沉積機(jī)制Fig.4 Schematic illustration of formation of SF/OCP composite coatings on Ti substrates by ECD technique

2.2 涂層的力學(xué)性能分析

表1示出OCP和SF/OCP涂層的彈性模量和硬度。為測量含有絲素蛋白和不含絲素蛋白2種涂層的力學(xué)性能差異，選取了絲素蛋白質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL制備得到的SF/OCP復(fù)合涂層和純OCP涂層進(jìn)行比較。由表1可知，與純OCP涂層相比，SF/OCP復(fù)合涂層(1.0 mg/mL)的彈性模量是其1.5倍，硬度是其4.3倍，表明SF/OCP復(fù)合涂層具有更好的力學(xué)性能。這可能是由于其結(jié)構(gòu)上的改變，當(dāng)電解液中添加絲素蛋白時(shí)，在涂層表面會(huì)形成納微米二級結(jié)構(gòu)，孔洞直徑和OCP晶帶寬度的減少能有效地促進(jìn)SF/OCP復(fù)合涂層表面形成更加致密的多孔結(jié)構(gòu)。此外，絲素蛋白和OCP之間的相互交聯(lián)也有助于復(fù)合涂層力學(xué)性能的提升。

表1 制備涂層的彈性模量和硬度Tab.1 Elastic modulus and hardness values of prepared coatings GPa

2.3 涂層表面蛋白質(zhì)吸附性能分析

圖5、6示出BSA和Fn在純Ti基底、純OCP涂層和SF/OCP復(fù)合涂層上的吸附量。

注：*表示與純Ti基底相比，p<0.05；#表示與純OCP涂層相比，p<0.05。圖5 BSA在純Ti基底、純OCP涂層和SF/OCP復(fù)合涂層上的吸附量Fig.5 BSA adsorption on pure Ti，pure OCP coating and SF/OCP composite coatings

由圖可知，純OCP涂層上的BSA蛋白吸附量是空白Ti基底上的2倍多，但在SF/OCP復(fù)合涂層上的BSA蛋白吸附量保持同一吸附水平，且明顯低于純OCP涂層上 的蛋白質(zhì)吸附量。Fn蛋白在SF/OCP 復(fù)合涂層上的吸附高于純OCP涂層和空白Ti基底上的吸附，且隨著絲素蛋白濃度的增加，復(fù)合涂層表面Fn蛋白吸附量增加。

注：*表示與純Ti基底相比， p<0.05；#表示與純OCP涂層相比， p<0.05。圖6 Fn在純Ti基底、純OCP涂層和SF/OCP復(fù)合涂層上的吸附量Fig.6 Fn adsorption on pure Ti，pure OCP coating and SF/OCP composite coatings

眾所周知，在體內(nèi)移植中BSA和Fn是最重要的2種蛋白質(zhì)，存在于復(fù)雜的生物體液和組織中。BSA是一種存在于血漿中的小型球狀血清蛋白，有助于調(diào)節(jié)滲透壓和低水溶性營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸。BSA的分子量較低，為66 kDa，導(dǎo)致其在體液中擴(kuò)散速度更快。一般來說，在生物學(xué)研究中，BSA被用來屏蔽細(xì)胞的非特異性粘附位點(diǎn)[6-7,13]。一些研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了片狀HAp粒子因其具有很大部分的b-c晶面而更容易吸附BSA分子[14]。OCP的晶體結(jié)構(gòu)與HAp有著很多相似之處，在OCP磷灰石層中的 4個(gè)鈣原子和4個(gè)磷原子位置與HAp晶體中相應(yīng)原子幾乎完全匹配。BSA蛋白更快的擴(kuò)散速度和其在優(yōu)先晶面上更高的吸引力，使其在純OCP涂層上有更高的吸附量。與純OCP涂層晶帶在(100)晶面上的生長相比，隨著絲素蛋白的加入，復(fù)合涂層上OCP晶帶在這個(gè)方向上的生長受到抑制，晶帶寬度明顯減少。由于BSA分子快速的擴(kuò)散速度，與SF/OCP復(fù)合涂層相比，純OCP涂層表面具有更大的孔洞尺寸，可以吸附更多的BSA蛋白。

Fn蛋白不僅是最重要的細(xì)胞黏附蛋白，可促進(jìn)生物材料上細(xì)胞黏附和遷移，且在早期的成骨分化中也起到了重要的作用。一些研究表明，生物材料表面微觀形貌能影響相對大的蛋白質(zhì)的吸附。Fn蛋白的相對分子質(zhì)量較高，為250 kDa[15-17]。隨著電解液中絲素蛋白質(zhì)量濃度的增加，SF/OCP復(fù)合涂層具有更高的有序結(jié)構(gòu)和更大的表面積。由于表面積的增加，使得其有更多的非特異性Fn蛋白吸附。

2.4 涂層表面細(xì)胞活力分析

圖7示出HUMSCs細(xì)胞在純OCP涂層和SF/OCP復(fù)合涂層上培養(yǎng)1、3和7 d時(shí)的細(xì)胞增殖狀況?？芍?，經(jīng)過1 d的培養(yǎng)后，所有樣品之間沒有顯著性的差異，但經(jīng)過3、7 d培養(yǎng)后，SF/OCP復(fù)合涂層表面的細(xì)胞活力明顯高于純OCP涂層，而且具有顯著性差異。隨著復(fù)合涂層中絲素蛋白質(zhì)量濃度的增加，涂層表面細(xì)胞活力明顯增加，這種增加趨勢隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加越來越明顯。尤其在培養(yǎng)第 7 d時(shí)，SF/OCP復(fù)合涂層(1.0 mg/mL)表面的細(xì)胞活力是純OCP涂層上的1.28倍。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過程中，SF/OCP復(fù)合涂層(1.0 mg/mL) 和SF/OCP復(fù)合涂層(1.5 mg/mL)上的細(xì)胞活力沒有顯著性差異，這可能是由于這2種涂層之間具有極其相似的納微米多級結(jié)構(gòu)。

注：*表示涂層表面細(xì)胞活力的顯著性差異，p<0.05。圖7 HUMSCs在純OCP涂層和SF/OCP復(fù)合涂層上培養(yǎng)1、3和7 d時(shí)的細(xì)胞活力Fig.7 HUMSCs cell viability on pure OCP coating and SF/OCP composite coatings for 1, 3 and 7 d

在所有復(fù)合涂層中，具有更小微米級孔洞尺寸，更細(xì)的納米級晶體纖維和更好的Fn蛋白吸附的SF/OCP復(fù)合涂層(1.0 mg/mL)和SF/OCP復(fù)合涂層(1.5 mg/mL)顯示出更好的細(xì)胞活力。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，與具有單一尺度特性的樣品相比，納微米多級尺度的樣品能夠有效增強(qiáng)細(xì)胞活力。

3 結(jié) 論

1)本文通過調(diào)控電解液中絲素蛋白(SF)質(zhì)量濃度，采用電化學(xué)沉積方法制備出具有有序多孔結(jié)構(gòu)的磷酸八鈣(OCP)涂層和具有納微米多級結(jié)構(gòu)的SF/OCP復(fù)合涂層。經(jīng)研究表明：隨SF質(zhì)量濃度的增加，涂層表面孔洞直徑由(19.96 ± 6.96) μm減小到(1.56 ± 0.22) μm， OCP晶體寬度減小到(26.84 ± 8.2) nm；SF/OCP復(fù)合涂層(1.0 mg/mL) 的彈性模量和硬度分別比純OCP涂層增加了大約1.5和4.3倍。

2)SF/OCP復(fù)合涂層可選擇性地增強(qiáng)Fn的吸附，經(jīng)7 d細(xì)胞培養(yǎng)，SF/OCP復(fù)合涂層(1.0 mg/mL) 表面的細(xì)胞活力是純OCP涂層上的1.28倍。