倪 慧，李會軍

中國藥科大學天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，南京 210009

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子[1]。黃酮類成分是酸棗仁的主要化學成分之一。在2015 年版《中國藥典》中，酸棗仁“含量測定”項下黃酮類成分的檢測指標為斯皮諾素?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，除斯皮諾素外，酸棗仁中還含有6′′′-阿魏酰斯皮諾素這一含量較高、且具有較強生理活性的黃酮類成分。丁軻等[2]發(fā)現(xiàn)，在酸棗仁黃酮中抗氧化作用最強的組分是6′′′-阿魏酰斯皮諾素。宋偉等[3]通過3 種譜-效相關(guān)性分析方法，最終確認了6′′′-阿魏酰斯皮諾素是酸棗仁發(fā)揮解郁安神作用的有效成分之一。Qiao LD 等[4]發(fā)現(xiàn)，酸棗仁中的這2 種成分均能促進大鼠海馬神經(jīng)元中相關(guān)mRNA 的表達。因此，僅以斯皮諾素作為含量測定指標不能全面反映酸棗仁中黃酮類成分的內(nèi)在質(zhì)量，應該綜合考慮斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素等主要藥理活性成分的含量，故酸棗仁的質(zhì)量標準亟待修訂提高。

“一測多評（QAMS）”法既符合中藥多成分整體質(zhì)量控制的要求，又解決了對照品缺乏、檢測成本高的瓶頸問題[5]，這已成為行業(yè)內(nèi)認可度高、應用廣泛的中藥質(zhì)量控制模式[6]。

據(jù)文獻報道[7，8]，酸棗仁的一測多評法，主要用于它的另一主要成分皂苷類的同時定量分析，或者采用特定的色譜條件，同時測定皂苷類和斯皮諾素的含量；而目前還沒有酸棗仁主要黃酮類成分的QAMS 分析。故有必要建立酸棗仁中黃酮類成分的QAMS 質(zhì)量控制方法，以全面評價酸棗仁的質(zhì)量。

本研究建立以斯皮諾素為內(nèi)參物、同步測定酸棗仁中斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素2 個黃酮成分的一測多評法，并應用于29 批酸棗仁樣品的含量測定中，以期能為酸棗仁藥典標準的完善提供技術(shù)依據(jù)，進一步加強酸棗仁臨床用藥的安全有效性。

1 儀器與藥品、試劑

Shimadzu LC-20A 高效液相色譜儀，包括LC-20AT 溶液傳輸單元，SIL-20A 自動進樣器，SPD M20A 二極管陣列檢測器，LC Solution 色譜工作站；Agilent 1260 高效液相色譜儀；Mettler Toledo ME104 電子天平；Sartorius BT125D 電子天平。

6′′′-阿魏酰斯皮諾素對照品（批號PS0477-0025，純度＞98%，成都普思生物科技股份有限公司）；斯皮諾素對照品為本實驗室自制，純度＞98%；乙醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；水為純凈水。

從河北、山東、陜西等酸棗仁主產(chǎn)地共收集了29 批藥材（樣品1～8，河北；樣品9，安徽；樣品10～17，山東；樣品18～20、23，陜西；樣品21～22，陜北；樣品24～25，河南；樣品26～27，山西；樣品28，遼寧；樣品29，甘肅），所有藥材經(jīng)中國藥科大學劉慧娟老師鑒別為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的種子，樣品保存于本校天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性

Shimadzu LC-20A 高效液相色譜儀；Shimadzu Inertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：0.1%乙酸（A）-乙腈（B）（梯度洗脫：0～5 min，14%B，5～10min，14%～17%B，10～22min，17%～19%B，22～40 min，19%～19% B，40～42 min，19%～95% B）；檢測波長：335 nm；柱溫：16 ℃；流速：1 mL·min-1；進樣體積10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 酸棗仁對照品及樣品高效液相色譜圖

各色譜峰分離度＞1.5，拖尾因子≈1.00，理論塔板數(shù)按6′′′-阿魏酰斯皮諾素峰計算不低于2000。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取斯皮諾素對照品20.08 mg 和6′′′-阿魏酰斯皮諾素對照品10.04 mg，置20 mL 量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為1.004 mg·mL-1和0.502 mg·mL-1的混合溶液，即得1號混合對照品溶液；將該溶液分別稀釋4/3、2、4、20、40、100 倍，制備得2 號～7 號混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取酸棗仁粉末（過四號篩）約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加環(huán)己烷40 mL，加熱回流3 h，棄去環(huán)己烷液，固體物揮去溶劑，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入70%乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性、檢測限及定量限 分別精密吸取“2.2”項下7 個濃度的混合對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素的峰面積。以質(zhì)量濃度X（μg·mL-1）對峰面積Y（mAU）作線性回歸處理，得到各成分的回歸方程、r2及線性范圍；同時，對混合對照品7 號逐級稀釋，進樣測定，各成分以信噪比為3 時的質(zhì)量濃度為檢測限，信噪比為10 時的質(zhì)量濃度為定量限。由表1 的結(jié)果表明，2 個黃酮活性成分在較寬的質(zhì)量濃度范圍（100 倍）內(nèi)有良好的線性，且有較高的靈敏度。

2.4.2 加樣回收率試驗 分別精密稱取斯皮諾素對照品37.30 mg 和6′′′-阿魏酰斯皮諾素對照品11.45 mg，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為0.7460 mg·mL-1和0.2290 mg·mL-1的混合對照品溶液。

表1 線性回歸方程、檢測限及定量限

平行稱定0.5 g 樣品9 份，置100 mL 具塞錐形瓶中。按照3 種不同濃度水平（低、中、高）將混合對照品溶液準確加入到每個具塞錐形瓶中，每個濃度平行3 份。取對照品的添加量分別為0.5 g 樣品中對照品含量的80%（0.8 mL 混合對照品溶液）、100%（1.0 mL 混合對照品溶液）和120%（1.2 mL 混合對照品溶液），按照“2.3”項下方法制備供試品溶液。以對照品比較法計算各成分的測得量，并按照公式，計算各成分的加樣回收率：

加樣回收率=（測得量-樣品含量）/加入量×100%

表2 結(jié)果顯示，斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素的加樣回收率均在94%～106%，表明方法準確度良好。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n=3）

2.4.3 重復性試驗 以高、中、低3 種濃度水平分別平行稱量3 份樣品（高水平稱量為1.5 倍的原始稱樣量，中水平稱量為1 倍的原始稱樣量，低水平稱量為0.5 倍的原始稱樣量），按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣10 μL，測定斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素含量，計算RSD 值。斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素在高、中、低3 種濃度水平下測得含量的RSD 均小于2%，方法的重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于樣品制備后0、2、4、6、8、12、18、24 h 進樣，測定峰面積，計算RSD。測得斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素峰面積的RSD 分別為0.26%和0.85%，表明酸棗仁的供試品溶液在24 h 內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 相對校正因子的確定

2.5.1 相對校正因子的計算 以斯皮諾素為內(nèi)參物，采用斜率校正法[9]計算6′′′-阿魏酰斯皮諾素的相對校正因子。將“2.2”項下制備的1 號～7 號混合對照品溶液進樣，測定斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素的線性回歸方程，兩者的線性斜率之比即為6′′′-阿魏酰斯皮諾素的相對校正因子（以f 表示）。

2.5.2 相對校正因子的耐用性

（1）不同儀器和不同色譜柱對相對校正因子的影響。試驗采用3 種不同的色譜柱，分別在Shimadzu LC-20A 和Agilent 1260 液相色譜儀上對f進行測定。結(jié)果顯示，在兩種高效液相色譜儀上所測定的f 的RSD＜3.3%；在同一儀器下3 種色譜柱測定的f 的RSD＜4.3%，表明f 在不同高效液相色譜儀和不同色譜柱上的耐用性較好。見表3。

表3 不同儀器和不同色譜柱上測得的相對校正因子（f）和相對保留時間（tR′）

（2）不同流速和不同柱溫對相對校正因子的影響。采用Shimadzu LC-20A 高效液相色譜儀和Shimadzu Inertsil ODS-3 色譜柱，分別測定在不同流速（0.9、1.0、1.1 mL·min-1）和不同柱溫（14 ℃、16 ℃、18 ℃）下的f，計算RSD。測得的f 在不同流速和不同柱溫下的RSD 分別為0.50%和0.34%，表明f 在流速0.9～1.1 mL·min-1和柱溫14 ℃～18 ℃的耐用性良好。

2.5.3 相對校正因子的平均值 取以上考察的各色譜條件下的f 的平均值，作為6′′′-阿魏酰斯皮諾素相對于斯皮諾素的校正因子，最終確定為0.73。

2.6 待測成分色譜峰的定位

試驗采用3 種不同的色譜柱，分別在Shimadzu LC-20A 和Agilent 1260 液相色譜儀上、測定2 個黃酮活性成分的保留時間。采用相對保留值法[9]，即待測成分與內(nèi)參物保留時間的比值，計算6′′′-阿魏酰斯皮諾素相對于斯皮諾素的保留時間，作為待測成分色譜峰定位的依據(jù)。最終確定6′′′-阿魏酰斯皮諾素的相對保留時間（tR′）為1.84。見表3。

表4 ESM 法和QAMS 法測得的酸棗仁中2 個黃酮活性成分的含量（n=3，%）

2.7 樣品含量測定及對QAMS 法的驗證

分別采用外標法（ESM）和QAMS 法對收集的29 批酸棗仁的斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素的含量進行同步測定，并將兩種方法所得含量測定結(jié)果以相對誤差（RE）進行評價，以驗證QAMS 法測定上述2 個黃酮活性成分含量的準確性。

由表4 可見，ESM 法和QAMS 法所得含量測定結(jié)果無顯著性差異，相對誤差均＜1.0%，表明所建立的QAMS 法用于酸棗仁中2 個黃酮活性成分的含量測定具有良好的準確性。酸棗仁樣品中斯皮諾素的含量在0.117%～0.183%；6′′′-阿魏酰斯皮諾素的含量在0.0382%～0.0778%；2 個成分的含量均較高且較為穩(wěn)定，其中，斯皮諾素的含量符合2015 年版《中國藥典》的限量要求（≥0.080%）。

3 討論

本試驗在現(xiàn)有文獻研究的基礎(chǔ)上，建立了以斯皮諾素為內(nèi)參物、同步測定酸棗仁中斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素2 個黃酮活性成分的一測多評法。該方法檢測成本低、耐用性強、重現(xiàn)性好、準確度高，可為修訂酸棗仁的質(zhì)量標準提供技術(shù)依據(jù)；在應用于酸棗仁的質(zhì)控中，保障其臨床用藥的安全有效。

3.1 供試品制備方式和色譜條件的建立和優(yōu)化

本試驗對供試品溶液的提取方式（超聲、回流、冷浸）、提取溶劑（50%乙醇、70%乙醇、乙醇）、提取體積（10、20、30 倍）及提取時間（10、20、30 min）等進行了單因素考察，確定了以1 g 樣品加70%乙醇20 mL、超聲提取20 min，超聲提取前以環(huán)己烷索氏回流脫脂的制備方法，與文獻[8]的制備方法相比，減少了制備時間，操作更為簡便。

本試驗通過考察最大吸收波長、流動相系統(tǒng)（甲醇-0.1%乙酸系統(tǒng)和乙腈-0.1%乙酸系統(tǒng)）、流動相酸度（0.05%乙酸、0.1%乙酸和0.15%乙酸）、流動相梯度洗脫、流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）以及柱溫，最終確定了液相色譜條件。采用這一條件，待測成分的理論塔板數(shù)增大，柱效提高，分離度和拖尾因子得到改善，方法的耐用性獲得了提升。

3.2 黃酮類成分相對校正因子的確立

本試驗以斯皮諾素為內(nèi)參物，建立了6′′′-阿魏酰斯皮諾素的相對校正因子，并從不同儀器、色譜柱、流速和柱溫等多個方面考察了相對校正因子的耐用性。前期文獻[7]采用一測多評法測定了酸棗仁中4 種皂苷類成分；本試驗補充了酸棗仁中測定黃酮類成分的一測多評法，可以為修訂酸棗仁的質(zhì)量標準提供較全面的技術(shù)依據(jù)。

3.3 樣品中黃酮類成分的含量測定結(jié)果分析

酸棗仁樣品中斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素的平均百分含量分別為0.148%和0.062%，結(jié)合樣品色譜圖，說明兩種化合物均為酸棗仁中的主要黃酮類成分。與《中國藥典》僅以斯皮諾素為單一指標相比，本試驗建立的酸棗仁中2 個黃酮活性成分“一測多評”法，可以更加有效地控制酸棗仁的質(zhì)量。