孟橋，那治國(guó)，王鑫，馬永強(qiáng)，孫貴堯

1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院（哈爾濱 150076）；2. 黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部（哈爾濱 150066）

黑木耳（Auricularia auricula）又名云耳和光木耳，是一種藥食皆用膠質(zhì)真菌，含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有延緩衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、預(yù)防癌癥發(fā)生等生理保健功能[1]。其中，蛋白質(zhì)含量10%左右，且氨基酸種類齊全，含有人體所需的8種必需氨基酸，效價(jià)較高，可較好滿足機(jī)體日常所需[2]。另外，黑木耳蛋白水解后可獲得多種生物活性肽，如黑木耳活性肽與鈣的螯合物可有效降低骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)[3]。Sheu等[4]從黑木耳中提取一種等電點(diǎn)5.1的酸性蛋白，可加強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)。因而，對(duì)黑木耳蛋白質(zhì)進(jìn)行有效提取和開(kāi)發(fā)，不僅可擴(kuò)展優(yōu)質(zhì)蛋白的來(lái)源，而且對(duì)提升黑木耳的應(yīng)用價(jià)值和產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。提取植物蛋白的方法主要有堿法[5]、超聲波法[6]、水酶法[7]。其中，王振宇等[6]采取超聲波法提取黑木耳蛋白，在最佳條件下得率為2.6%，相對(duì)較低。王艷菲[8]對(duì)黑木耳4種蛋白進(jìn)行分級(jí)提取，得到蛋白質(zhì)提取率為36.3%（得率約4.2%），仍有大部分蛋白未被提取。這主要是由于黑木耳中存在大量糖類物質(zhì)，與蛋白發(fā)生錯(cuò)綜復(fù)雜的交互作用，束縛蛋白質(zhì)的釋放，導(dǎo)致其提取困難。有研究表明酶法提取結(jié)合超聲波和微波等新技術(shù)的處理提高蛋白質(zhì)和抗氧化化合物的提取效率[9]。因此，試驗(yàn)選擇木聚糖酶和纖維素酶對(duì)黑木耳均質(zhì)液進(jìn)行混合酶解，破壞多糖對(duì)蛋白質(zhì)的束縛，采用超聲波堿法提取黑木耳蛋白質(zhì)，提高黑木耳蛋白質(zhì)的提取效果，旨在為植物蛋白的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳（市售，產(chǎn)于黑龍江伊春五營(yíng)區(qū)，凱氏定氮測(cè)得蛋白質(zhì)含量10.17%）；牛血清白蛋白（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司）；纖維素酶（50 U/mg）、木聚糖酶（100 U/mg）（上海藍(lán)季科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

W177型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（南京桑力電子設(shè)備廠）；UV-5200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；KQ-500 VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限責(zé)任公司）；202型常壓恒溫烘箱（吳江歐博電熱設(shè)備有限公司）；pH計(jì)（上海精科儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑木耳蛋白質(zhì)的提取

1.3.1.1 酶解前處理

將黑木耳進(jìn)行清洗、干燥、粉碎、過(guò)孔徑0.180 mm篩，準(zhǔn)確稱取2 g黑木耳粉，添加一定比例的去離子水，混合均勻，打入膠體磨中，進(jìn)行開(kāi)機(jī)循環(huán)5 min，在20 MPa下均質(zhì)10 min，調(diào)節(jié)適當(dāng)pH，控制酶解時(shí)間和溫度，添加適量的混合酶（木聚糖酶和纖維素酶按1∶1比例混合）進(jìn)行酶解，在90 ℃進(jìn)行滅酶15 min。

1.3.1.2 黑木耳蛋白的提取

前處理的酶解液，采用超聲波堿法提取蛋白質(zhì)，將酶解后的溶液調(diào)整pH，在一定功率、溫度下采用超聲波提取一定時(shí)間后，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液，定容，以添加同質(zhì)量滅活的混合酶為對(duì)照，采用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定提取液中蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 黑木耳蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將配置好的1 000 μ g/mL BSA（牛血清蛋白）標(biāo)準(zhǔn)液0，0.02，0.04，0.06，0.08和0.10 mL分別移入試管中，并用蒸餾水定容至1 mL，在試管中分別加入考馬斯亮藍(lán)試劑5 mL，搖勻，靜置2 min后在595 nm下測(cè)定吸光度，以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)-考馬斯亮藍(lán)結(jié)合物的吸光度作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 樣品中蛋白質(zhì)的測(cè)定

分別抽取1 mL稀釋過(guò)的樣品溶液至試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，充分搖勻，2 min后在595 nm下測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中黑木耳蛋白質(zhì)量濃度，按式（1）計(jì)算蛋白質(zhì)的得率。

式中：C為黑木耳蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；M為黑木耳質(zhì)量，g；

1.4 測(cè)定條件的優(yōu)化

1.4.1 黑木耳均質(zhì)液酶解條件優(yōu)化

選擇纖維素酶和木聚糖酶，按1.3.1方法對(duì)黑木耳均質(zhì)液進(jìn)行混合酶解，固定提取條件為料液比1∶90g/mL、超聲時(shí)間40 min、超聲功率250 W、超聲溫度50 ℃、pH 9。以蛋白質(zhì)得率作評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究酶解溫度（20，30，40，50和60 ℃），pH（3，4，5，6和7）時(shí)間（0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h），酶添加量（0.4%，0.6%，0.8%，1.0%和1.2%）等因素對(duì)蛋白提取效果的影響。

1.4.2 提取條件的單因素試驗(yàn)

選取酶解前處理最優(yōu)條件的酶解液，按1.3.1的方法提取黑木耳蛋白質(zhì)，研究料液比（1∶70，1∶80，1∶90，1∶100和1∶110 g/mL），超聲時(shí)間（20，30，40，50和60 min），超聲功率（200，250，300，350和400 W），超聲溫度（20，30，40，50和60℃），pH（8.0，8.5，9.0，9.5和10.0）對(duì)黑木耳蛋白質(zhì)得率的影響。

1.4.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

利用方差分析，使用SPSS 13.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)黑木耳提取條件單因素?cái)?shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間對(duì)黑木耳蛋白質(zhì)得率有顯著影響（p＜0.05）。以黑木耳蛋白質(zhì)得率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，借助Design Expert 8.0.6.1軟件選用Box-Behnken試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)提取條件進(jìn)行分析與優(yōu)化，試驗(yàn)因素以及水平如表1。

1.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Design-Expert 8.0.6.1軟件分析得到的黑木耳蛋白最佳提取條件，并參考試驗(yàn)的可行性，提取黑木耳蛋白，并按照1.3.2方法測(cè)定黑木耳蛋白得率。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)取平均值，借助SPSS 13.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和顯著分析，借助Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

表1 響應(yīng)面因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，回歸方程為y=0.007x+0.022 3（R2=0.991 4）。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 纖維素酶與木聚糖酶混合酶解條件的單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶解溫度對(duì)得率的影響

采用纖維素酶和木聚糖酶對(duì)其進(jìn)行混合酶解，以降低多糖對(duì)蛋白質(zhì)的影響。不同酶解溫度對(duì)得率影響如圖2所示，隨著酶解溫度升高，得率呈先上升后下降趨勢(shì)。20～50 ℃時(shí)蛋白質(zhì)得率逐漸上升，50 ℃時(shí)得率達(dá)到最高，是由于升高溫度，酶活性逐漸增加，加快酶反應(yīng)速率；50 ℃之后得率逐漸下降，這是由于超過(guò)限定的溫度范圍，酶受熱變性影響導(dǎo)致其逐漸失活。與Liu等[10]結(jié)果一致，因此確定混合酶的最適水解溫度為50 ℃。

2.2.2 酶解pH對(duì)得率的影響

如圖3所示，相同條件下，pH 4時(shí)蛋白質(zhì)得率最高。隨著pH逐漸上升蛋白質(zhì)得率逐漸下降可能是由于pH逐漸上升，酶反應(yīng)受到抑制，導(dǎo)致得率逐漸降低。與孔祥佳等[11]結(jié)果一致，結(jié)果表明，pH 4時(shí)混合酶活性最好。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)得率的影響

如圖4所示，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)得率逐漸升高直至平緩。酶解時(shí)間在0.5～2 h時(shí)，蛋白質(zhì)得率迅速遞增，這是由于隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，酶逐漸發(fā)揮作用，促使蛋白質(zhì)分子溶出率逐漸提高；2 h后酶解效率逐漸緩慢，說(shuō)明酶解反應(yīng)逐漸完全，混合酶于2 h左右反應(yīng)基本結(jié)束。與劉靜波等[12]研究結(jié)果一致，鑒于試驗(yàn)效率及試驗(yàn)資源等因素，選取2 h作為最佳條件。

圖2 酶解溫度對(duì)得率的影響

圖3 酶解pH對(duì)得率的影響

圖4 酶解時(shí)間對(duì)得率的影響

2.2.4 酶添加量對(duì)得率影響

由圖5得，酶添加量在0.4%～0.8%時(shí)，蛋白質(zhì)得率逐漸升高，酶添加量大于0.8%得率逐漸下降。隨著酶添加量增加，酶反應(yīng)效果逐漸加強(qiáng)，蛋白質(zhì)逐漸溶出。蛋白質(zhì)得率在酶添加量0.8%之后逐漸下降，Shen等[13]研究表明酶添加量過(guò)高，引發(fā)酶的相互抑制效應(yīng)，與蛋白質(zhì)形成復(fù)合體系，酶活受到抑制。因此，選取最適酶添加量為0.8%。

2.2.5 黑木耳酶解最佳工藝條件

采用纖維素酶和木聚糖酶1∶1比例混合酶解，確定最佳酶解條件為酶解溫度50 ℃、酶解pH 4、酶解時(shí)間2 h、酶添加量0.8%。

圖5 酶添加量對(duì)得率的影響

2.3 黑木耳蛋白質(zhì)提取條件的單因素試驗(yàn)

2.3.1 料液比對(duì)得率的影響

如圖6所示，在相同條件下，隨著料液比加大，黑木耳蛋白質(zhì)得率逐步呈上升趨勢(shì)，1∶90 g/mL時(shí)得率達(dá)到最高，而后又逐漸降低。料液比較小時(shí)，黑木耳粉本身溶解不完全，并且黑木耳中含有可溶性多糖導(dǎo)致溶液黏度較大，分子擴(kuò)散速度緩慢，蛋白質(zhì)溶出率較低[14]；隨著料液比不斷加大得率反而下降可能是由于與水分子結(jié)合不緊密，提取不完全。與Yu等[15]研究結(jié)果一致，所以選取最佳料液比條件為1∶90 g/mL。

圖6 料液比對(duì)得率的影響

2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)得率的影響

如圖7所示，蛋白質(zhì)得率隨超聲時(shí)間增加，呈先上升后下降趨勢(shì)。20～40 min時(shí)隨時(shí)間增加，得率隨之逐漸上升，是由于黑木耳的細(xì)胞壁被破壞完全，從而增大蛋白質(zhì)的溶出效果；40 min后，超聲時(shí)間不斷延長(zhǎng)，得率反而降低，說(shuō)明超聲時(shí)間越長(zhǎng)流出的可溶性雜質(zhì)越多，反而造成干擾。與蔡沙等[16]研究結(jié)果相符，最終確定最佳超聲時(shí)間為40 min。

2.3.3 超聲功率對(duì)得率的影響

如圖8所示，相同條件下，隨著超聲功率增加，黑木耳蛋白質(zhì)得率呈先上升后下降趨勢(shì)，與劉靜等[17]研究結(jié)果一致；但是上下浮動(dòng)較小，并未隨著超聲功率增加而明顯提高，一直趨于穩(wěn)定，說(shuō)明超聲功率對(duì)蛋白提取效果影響不顯著（p＞0.05）。故選取得率較高的超聲功率250 W作為最佳條件。

2.3.4 超聲溫度對(duì)得率的影響

由圖9可知，超聲溫度對(duì)蛋白質(zhì)得率影響較為明顯，得率呈先上升后下降趨勢(shì)。在20～50 ℃之間，得率隨溫度的升高呈正相關(guān)趨勢(shì)，可能是隨著溫度提升，蛋白質(zhì)分子熱運(yùn)動(dòng)加快，蛋白質(zhì)分子的溶出速率大幅提升[18]。超聲溫度超過(guò)50 ℃之后得率逐漸降低，可能由于溫度過(guò)高，溶液中黑木耳多糖溶出，增大溶液黏度，阻礙黑木耳蛋白提取。與趙見(jiàn)軍等[19]研究結(jié)果一致，綜合考慮選取最佳超聲溫度為50 ℃。

圖7 超聲時(shí)間對(duì)得率的影響

圖8 超聲功率對(duì)得率的影響

圖9 超聲溫度對(duì)得率的影響

2.3.5 pH對(duì)得率的影響

如圖10所示，相同條件下，pH在8～9時(shí)得率逐漸增長(zhǎng)，pH大于9后，蛋白質(zhì)得率逐漸平穩(wěn)且有少量下降，可能是由于堿性過(guò)強(qiáng)，溶液黏稠度增大，且在強(qiáng)堿條件下提取的蛋白質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值會(huì)降低[20]。與侯玲等[21]研究結(jié)果一致，堿液增加到一定程度后，蛋白質(zhì)得率上升緩慢或有所下降，過(guò)高的堿液濃度加快美拉德反應(yīng)的進(jìn)行[22]。綜合考慮選取得率較高且堿液濃度不高的pH 9作為最佳提取條件。

圖10 pH對(duì)得率的影響

2.4 響應(yīng)面結(jié)果與分析

響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

采用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，擬合二次回歸方程為Y=-28.686 25+0.607 18A+0.113 25B+0.161 17C+1.900 00×10-3AB-8.250 00×10-4AC+9.000 00×10-4BC-3.672 50×10-3A2-3.297 50×10-3B2-1.622 50×10-3C2。

表2 Box-Behnken黑木耳蛋白質(zhì)提取優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.1 方差分析

由表3可知此法模型F=51.82，p＜0.000 1，表明模型具有顯著差異，失擬項(xiàng)p=0.304 7＞0.05（不顯著），表明回歸模型本身對(duì)其影響極顯著。決定系數(shù)R2=0.985 2，校正決定系數(shù)R2adj=0.966 2，表明響應(yīng)值變化的96.6%能用此模型解釋，黑木耳蛋白質(zhì)得率與模型模擬程度良好，能很好預(yù)測(cè)黑木耳蛋白得率的變化，且較好反映出各因素與響應(yīng)值關(guān)系。

2.4.2 響應(yīng)面各因素交互作用分析及驗(yàn)證試驗(yàn)

響應(yīng)面及等高線圖如圖11～圖13曲線梯度反映各因素對(duì)得率影響程度，響應(yīng)面越彎曲則表示此因素對(duì)蛋白質(zhì)得率影響越大[23]。各因素對(duì)黑木耳蛋白質(zhì)得率的影響效果表明，A、B對(duì)黑木耳蛋白得率影響顯著（p＜0.01），交互作用AB影響顯著（p＜0.01）AC、BC影響都較顯著（p＜0.05），A2、B2、C2（p＜0.01）對(duì)蛋白得率影響非常顯著。影響各因素對(duì)蛋白質(zhì)得率依次順序?yàn)榱弦罕龋ˋ）＞超聲溫度（B）＞超聲時(shí)間（C）；交互作用為AB＞BC＞AC。

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)為料液比1∶90.78 g/mL、超聲溫度48.80 ℃、超聲時(shí)間40.13 min，理論最佳測(cè)定結(jié)果為4.871%。根據(jù)試驗(yàn)的可控性以及驗(yàn)證預(yù)測(cè)條件的準(zhǔn)確性，實(shí)際操作試驗(yàn)條件為料液比1∶91 g/mL、超聲溫度49 ℃、超聲時(shí)間40 min，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)取平均值得到黑木耳蛋白得率為4.84%，較王振宇等[6]、王艷菲[8]、趙玉紅等[24]的得率有所提升。誤差較小說(shuō)明模型擬合度較高，模型能夠較好應(yīng)用于黑木耳蛋白提取工藝。

表3 回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)

圖11 料液比與超聲溫度對(duì)黑木耳蛋白質(zhì)得率影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖12 料液比與超聲時(shí)間對(duì)黑木耳蛋白質(zhì)得率影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖13 超聲溫度與超聲時(shí)間對(duì)黑木耳蛋白質(zhì)得率影響的響應(yīng)面及等高線圖

3 結(jié)論

以黑木耳為原料采用酶法進(jìn)行前處理后超聲波堿法提取黑木耳蛋白質(zhì)。

采用纖維素酶和木聚糖酶1∶1比例混合酶解，確定最佳條件為酶解溫度50 ℃、酶解pH 4、酶解時(shí)間2 h、酶添加量0.8%。

采用超聲波堿法提取黑木耳蛋白質(zhì)，探究料液比、超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度、pH等因素對(duì)得率的影響，確定最佳條件為料液比1∶90 g/mL、超聲時(shí)間40 min、超聲功率250 W、超聲溫度50 ℃、pH 9。其中，料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度影響較為顯著（p＜0.05）。

采用響應(yīng)面分析超聲波堿法的最佳提取條件，并用Box-Behnken響應(yīng)面對(duì)超聲波輔助堿法優(yōu)化提取條件，最終得出提取黑木耳蛋白質(zhì)最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1∶91 g/mL、超聲溫度49 ℃、超聲時(shí)間40 min，在此時(shí)黑木耳蛋白得率達(dá)到4.84%。通過(guò)對(duì)響應(yīng)面的分析獲得了黑木耳蛋白提取最佳工藝，為其提取工藝增加重要的理論依據(jù)及實(shí)用價(jià)值。