劉宏偉，王玉華

作者單位：1滄州市傳染病醫(yī)院肝病科，河北 滄州061001；2滄州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 滄州061001

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種嗜肝性雙鏈DNA 病毒，其生物活性及復(fù)制水平受各種因素影響，HBV 感染可導(dǎo)致急性或慢性肝炎，是引起肝纖維化、肝硬化、肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)HBV 基因組X 區(qū)編碼的乙型肝炎病毒X 蛋白（HBx）及其羧基端截?cái)囿w在HBV 相關(guān)性肝炎發(fā)展為肝細(xì)胞癌過程中發(fā)揮重要作用。微小RNA-155（MicroRNA-155，Mir-155）是一個(gè)多功能miRNA，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，呈遞抗原，調(diào)控免疫過程中細(xì)胞因子生成等，與變應(yīng)性鼻炎、慢性乙型肝炎（CHB）等多種炎癥性疾病及肝癌有關(guān)。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3）屬于NOD 樣受體分子，作為固有免疫重要組分在機(jī)體免疫及疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，主要由HBx蛋白與線粒體外孔蛋白結(jié)合后活性氧水平增加激活，與糖尿病合并慢性牙周炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝癌等疾病有關(guān)。然而關(guān)于Mir-155 聯(lián)合NLRP3與CHB 的關(guān)系尚鮮有報(bào)道，因此本研究擬通過檢測(cè)CHB 病人外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）Mir-155、NLRP3 水平，擬探究其與HBV-DNA 載量的關(guān)系及其可能機(jī)制，以期為CHB病人靶向治療提高一定理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年6 月至2019 年9 月滄州市傳染病醫(yī)院收治經(jīng)肝臟病理活檢證實(shí)CHB 病人118 例為CHB 組，男性65 例，女性53 例，年齡（58.29±13.21）歲，年齡范圍為22～70 歲，其中HBVDNA ＜1×10拷貝/毫升（低載量組）51 例，1×10拷貝/毫升HBV-DNA ≤1×10拷貝/毫升（中載量組）38例，HBV-DNA ＞1×10拷貝/毫升（高載量組）29例，e抗原陽性病人57 例，e 抗原陰性病人61 例；穿刺肝組織病理診斷按照慢性肝炎炎癥分級(jí)分為G2 級(jí)51例，G3 級(jí)32 例，G4 級(jí)35 例；按照肝纖維化分期分為S2 期56 例，S3 期39 例，S4 期23 例。另選取同期門診健康體檢者118 例為健康對(duì)照組，男性61 例，女性57 例，年齡（56.14±12.36）歲，年齡范圍為22～73歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)過滄州市傳染病醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，批準(zhǔn)文號(hào)1710021，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。收集所有受試者臨床檢查資料，所有樣品采集及資料調(diào)查均取得病人及其近親屬知情同意并簽字確認(rèn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015版）》關(guān)于CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）均為HBV 感染型肝炎病人；（3）血液樣品采集前未接受任何保肝降酶等藥物治療；（4）均自愿配合本次調(diào)查研究者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并非酒精性脂肪肝、其他類型肝炎病毒感染、肝癌或其他惡性腫瘤者；（2）妊娠或哺乳期婦女；（3）合并心、肺、腎等臟器功能障礙者；（4）合并自身免疫性疾病者；（5）臨床資料不完整者。

1.3 方法

1.3.1 試劑及主要儀器 RNA 提取試劑盒（編號(hào)R0011）購(gòu)自上海碧云天有限公司；淋巴細(xì)胞分離液（貨號(hào)abs930）購(gòu)自上海愛必信生物科技有限公司；PrimeScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（貨號(hào)6210A）、microRNA 定量（qRT-PCR）試劑盒（編號(hào)638314）、TB Green? Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（編號(hào)RR820A）均購(gòu)自大連寶生物科技有限公司；引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成；蛋白抽提試劑盒（批號(hào)P0028）、BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)P0010S），購(gòu)自上海碧云天有限公司；人IL-1β試劑盒（貨號(hào)BMS213HS）、人IL-18 ELISA 試劑盒（貨號(hào)KMC0181）、兔源一抗NLRP3 抗體（貨號(hào)PA5-20838）、GAPDH 抗體（貨號(hào)TAB1001），二抗羊抗兔IgG（貨號(hào)A32731）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen。MODEL550型酶標(biāo)儀、7300 RT-qPCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）等。

1.3.2 標(biāo)本采集 收集所有受試者清晨空腹外周靜脈血6 mL，分兩份保存，每份3 mL，其中一份添加淋巴細(xì)胞分離液提取PBMC，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。另一份于室溫下3 000 r/min（有效離心半徑5 cm）離心15 min分離血清。兩份采集標(biāo)本立即送檢或置于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.3.3 血清HBV-DNA 載量檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測(cè)血清HBV-DNA載量。

1.3.4 PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 水平 采用RNA 提取試劑盒提取PBMC 總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用RT-qPCR 法對(duì)Mir-155、NLRP3 mRNA 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系共25 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）/TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5 μL，cDNA（50 ng/μL）2 μL，上反向引物（10 μmol/L）各1 μL，雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，5 s；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，15 s；40 個(gè)循環(huán)；添加溶解曲線。Mir-155 正向引物序列（5′→3′）為：TTA ATG CTA ATC GTG ATA GGG GT，反向引物序列（5′→3′）為：CCT TAA AAC TCC ACT AGA AGC A；NLRP3 mRNA 正向引物序列（5′→3′）為：CGT GAG TCC CAT TAA GAT GGA GT，反向引物序列（5′→3′）為：CCC GAC AGT GGA TAT AGA ACA GA-3；內(nèi)參U6 正向引物序列（5′→3′）為：GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T，反向引物序列（5′→3′）為：CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT；GAPDH 正向引物序列（5′→3′）為：GTC GAT GGC TAG TCG TAG CAT CGA T；反向引物序列（5′→3′）為：TGC TAG CTG GCA TGC CCG ATC GAT C。 PBMC Mir-155、NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用2法進(jìn)行分析。

1.3.5

PBMC 中NLRP3 蛋白表達(dá)水平 采用免疫印跡（Western blot，WB）檢測(cè)PBMC 中NLRP3 蛋白表達(dá)。采用蛋白抽提試劑盒提取PBMC 總蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量蛋白樣品于80 mV 電壓下6%SDS-PAGE 電泳2 h，250 mA 下PVDF 膜轉(zhuǎn)膜70 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入適量含2%脫脂奶粉的PBS 稀釋，加NLRP3（1∶200）及健康對(duì)照GAPDH 抗體（0.5 μg/mL）4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜3 次，每次20 min，用適量含2%脫脂奶粉的PBS 稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG（1∶5 000）室溫孵育1.5 h，按上述方法洗膜，顯色，曝片，觀察并分析結(jié)果。

1.3.6

血清IL-1β、IL-18 水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELLSA）檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）水平，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以x ± s表示，兩組間比較用t 檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA 檢驗(yàn)），進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，兩兩比較采用χ檢驗(yàn)。采用Pearson 法分析PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA及其血清IL-1β、IL-18水平的相關(guān)性。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 CHB病人與健康對(duì)照組一般資料比較

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），與健康對(duì)照組比較，CHB組血清肝功能指標(biāo)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

2.2 不同HBV-DNA載量CHB病人PBMC 中Mir

-

155、NLRP3 水平比較

與HBV-DNA 低載量組比較，中、高載量組CHB 病人PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 及蛋白水平依次增加，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2，圖1。

圖1 不同HBV-DNA載量CHB病人PBMC中NLRP3蛋白表達(dá)

表2 不同HBV-DNA載量CHB病人外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中Mir-155、NLRP3水平比較/x ± s

2.3 不同HBV-DNA 載量CHB 病人血清IL

-

1

β

、IL

-

18 水平比較

與HBV-DNA 低載量組比較，中、高載量組CHB 病人血清IL-1β、IL-18 水平依次增加，與HBV-DNA 中載量組比較，高載量組CHB 病人血清IL-1β、IL-18 水平均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 不同HBV-DNA載量CHB病人血清IL-1β、IL-18水平比較/（ng/L，x ± s）

2.4 PBMC 中Mir

-

155、NLRP3 mRNA 水 平 與CHB 病人肝炎炎癥分級(jí)及肝纖維化分期的關(guān)系

隨肝炎炎癥分級(jí)增加、肝纖維化分期增加，PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 水平依次增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），見表4。

2.5 CHB 病人PBMC 中Mir

-

155、NLRP3 蛋白水平的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CHB 病人PBMC 中Mir-155、NLRP3 水平呈顯著正相關(guān)（r=0.714，P ＜0.05）。見圖2。

圖2 CHB病人外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中Mir-155、NLRP3水平的相關(guān)性

2.6 CHB病人PBMC中Mir-155、NLRP3水平與血清IL-1

β

、IL-18水平相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CHB 病人PBMC 中Mir-155 與血清IL-1β、IL-18水平均呈正相關(guān)（P ＜0.05），NLRP3水平與血清IL-1β、IL-18水平呈顯著正相關(guān)（P ＜0.05）。見表5。

表5 CHB病人外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中Mir-155、NLRP3水平與血清IL-1β、IL-18水平相關(guān)性

3 討論

CHB 是一種重大肝臟傳染性疾病，全球約20多億HBV 攜帶者，3.6 億CHB 病人，且每年約有60 萬人因HBV 相關(guān)性肝衰竭、肝硬化或肝細(xì)胞癌死亡，嚴(yán)重危害人類健康。目前臨床治療CHB 多以干擾素、核酸類等藥物為主，以靶向病毒逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域破壞HBV-DNA 合成，但HBV-DNA 感染機(jī)及發(fā)病制尚不完全清楚，因此尋找HBV-DNA 復(fù)制相關(guān)的生物分子進(jìn)行CHB 靶向治療具有重要意義。miRNA，是一類長(zhǎng)鏈非編碼小RNA，與先天性和獲得性免疫密切相關(guān)，其中Mir-155 在免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Abdul-Maksoud 等研究發(fā)現(xiàn)，Mir-155 與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）疾病活動(dòng)度及炎癥程度有關(guān)，血清Mir-155表達(dá)水平在RA 病人中顯著高于健康對(duì)照組，且與腫瘤壞死因-α（TNF-α）、IL-1β 水平均呈正相關(guān)。Fang 等研究報(bào)道，與健康對(duì)照組比較，HBV 攜帶者及CHB 病人CD4+、CD8+T 細(xì)胞中Mir-155 水平依次升高，CHB病人PBMC 中Mir-155水平升高與T細(xì)胞活化有關(guān)，是HBV 感染免疫激活疾病進(jìn)展的潛在標(biāo)志物。吳曉升等研究報(bào)道，與健康對(duì)照組比較，CHB 病人PBMC 中Mir-155 水平顯著 下 調(diào)，與ALT 正 常 的CHB 病 人 比 較，ALT 升 高 的CHB 病 人PBMC 中Mir-155 水平顯著升高，且于HBV-DNA 無相關(guān)性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較，CHB 病 人PBMC 中Mir-155 水 平 顯 著 升 高，隨HBV-DNA 載量增加，CHB 病人PBMC 中Mir-155 水平依次升高，且與血清IL-1β、IL-18 水平均呈正相關(guān)，而IL-1β、IL-18均為IL-1家族中重要促炎因子，與Fang 等結(jié)果一致，提示Mir-155 水平升高可能與CHB 病人HBV-DNA 復(fù)制有關(guān)，參與CHB 炎癥反應(yīng)。但與吳曉升等研究結(jié)果不一致，可能，因樣本量選擇差異，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

表4 外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中Mir-155、NLRP3 mRNA水平與CHB病人肝炎炎癥分級(jí)及肝纖維化分期的關(guān)系/x ± s

炎性小體由多種分子共同構(gòu)成的高分子質(zhì)量、多蛋白復(fù)合體，在固有免疫中其重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)NLRP1、NLRP3、黑色素瘤缺失基因2 及ICE 蛋白酶激活因子4 中炎性小體，其中NLRP3 目前研究最多，結(jié)構(gòu)和功能最為明確。研究報(bào)道，HBV 表達(dá)的HBx蛋白可上調(diào)NLRP3炎性小體表達(dá)，NLRP3激活后可刺激半胱天冬氨酸氨基酶-1 前提剪切活化為具有酶活性的Caspase-1，進(jìn)而促進(jìn)IL-1β、IL-18等促炎因子成熟并釋放至胞外參與機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)。何子凡等研究報(bào)道，NLRP3 炎癥小體參與慢性阻塞性肺疾?。璺危┎∪搜装Y反應(yīng)，與健康對(duì)照組比較，穩(wěn)定期、急性加重期慢阻肺病人PBMC 中NLRP3 mRNA、IL-1β、IL-18 水平依次增高。張任飛等研究報(bào)道，與正常組、單純2 型糖尿?。═2DM）組、單純慢性牙周炎（CP）組比較，T2DM合并CP 組 病 人 血 清NLRP3、Caspase-1 mRNA 及IL-1β 水平顯著升高，且呈正相關(guān)，提示NLRP3 及IL-1β 可促進(jìn)T2DM 合并CP 病人炎癥反應(yīng)，與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHB 病人PMBC中NLRP3 mRNA 及蛋白水平隨HBV-DNA 載量增加而升高，均高于健康對(duì)照組，且與Mir-155 及血清IL-1β、IL-18 水平均呈正相關(guān)，與何子凡等、張任飛等研究結(jié)果一致。而陳洪濤等研究報(bào)道，與健康對(duì)照組比較，CHB 病人PBMC 中NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，干擾素誘導(dǎo)蛋白16(IFI16)炎癥小體水平顯著升高，且于HBV-DNA 載量呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果不一致，可能因樣本量選擇不同或CHB 病人HBV-DNA 感染過程中存在其他炎性小體共同參與。另本研究發(fā)現(xiàn)Mir-155、NLRP3 mRNA 水平與肝炎癥分級(jí)及肝纖維分期有關(guān)，綜合以上研究結(jié)果及本研究結(jié)果提示，Mir-155 可 能 協(xié) 同NLRP3 與CHB 病 人HBVDNA 復(fù)制有關(guān)，促進(jìn)CHB 病人炎癥反應(yīng)，有待進(jìn)一步深入探究。