劉宏偉,王玉華
作者單位:1滄州市傳染病醫(yī)院肝病科,河北 滄州061001;2滄州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北 滄州061001
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一種嗜肝性雙鏈DNA 病毒,其生物活性及復(fù)制水平受各種因素影響,HBV 感染可導(dǎo)致急性或慢性肝炎,是引起肝纖維化、肝硬化、肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)HBV 基因組X 區(qū)編碼的乙型肝炎病毒X 蛋白(HBx)及其羧基端截?cái)囿w在HBV 相關(guān)性肝炎發(fā)展為肝細(xì)胞癌過程中發(fā)揮重要作用。微小RNA-155(MicroRNA-155,Mir-155)是一個(gè)多功能miRNA,可介導(dǎo)炎癥反應(yīng),呈遞抗原,調(diào)控免疫過程中細(xì)胞因子生成等,與變應(yīng)性鼻炎、慢性乙型肝炎(CHB)等多種炎癥性疾病及肝癌有關(guān)。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3,NLRP3)屬于NOD 樣受體分子,作為固有免疫重要組分在機(jī)體免疫及疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,主要由HBx蛋白與線粒體外孔蛋白結(jié)合后活性氧水平增加激活,與糖尿病合并慢性牙周炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝癌等疾病有關(guān)。然而關(guān)于Mir-155 聯(lián)合NLRP3與CHB 的關(guān)系尚鮮有報(bào)道,因此本研究擬通過檢測(cè)CHB 病人外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)Mir-155、NLRP3 水平,擬探究其與HBV-DNA 載量的關(guān)系及其可能機(jī)制,以期為CHB病人靶向治療提高一定理論參考。
1.1 一般資料
選取2017 年6 月至2019 年9 月滄州市傳染病醫(yī)院收治經(jīng)肝臟病理活檢證實(shí)CHB 病人118 例為CHB 組,男性65 例,女性53 例,年齡(58.29±13.21)歲,年齡范圍為22~70 歲,其中HBVDNA <1×10拷貝/毫升(低載量組)51 例,1×10拷貝/毫升HBV-DNA ≤1×10拷貝/毫升(中載量組)38例,HBV-DNA >1×10拷貝/毫升(高載量組)29例,e抗原陽性病人57 例,e 抗原陰性病人61 例;穿刺肝組織病理診斷按照慢性肝炎炎癥分級(jí)分為G2 級(jí)51例,G3 級(jí)32 例,G4 級(jí)35 例;按照肝纖維化分期分為S2 期56 例,S3 期39 例,S4 期23 例。另選取同期門診健康體檢者118 例為健康對(duì)照組,男性61 例,女性57 例,年齡(56.14±12.36)歲,年齡范圍為22~73歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),具有可比性。本研究經(jīng)過滄州市傳染病醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過,批準(zhǔn)文號(hào)1710021,符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。收集所有受試者臨床檢查資料,所有樣品采集及資料調(diào)查均取得病人及其近親屬知情同意并簽字確認(rèn)。1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)
納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015版)》關(guān)于CHB診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)均為HBV 感染型肝炎病人;(3)血液樣品采集前未接受任何保肝降酶等藥物治療;(4)均自愿配合本次調(diào)查研究者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并非酒精性脂肪肝、其他類型肝炎病毒感染、肝癌或其他惡性腫瘤者;(2)妊娠或哺乳期婦女;(3)合并心、肺、腎等臟器功能障礙者;(4)合并自身免疫性疾病者;(5)臨床資料不完整者。
1.3 方法
1.3.1 試劑及主要儀器 RNA 提取試劑盒(編號(hào)R0011)購(gòu)自上海碧云天有限公司;淋巴細(xì)胞分離液(貨號(hào)abs930)購(gòu)自上海愛必信生物科技有限公司;PrimeScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit(貨號(hào)6210A)、microRNA 定量(qRT-PCR)試劑盒(編號(hào)638314)、TB Green? Premix Ex Taq?Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(編號(hào)RR820A)均購(gòu)自大連寶生物科技有限公司;引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成;蛋白抽提試劑盒(批號(hào)P0028)、BCA 蛋白定量試劑盒(批號(hào)P0010S),購(gòu)自上海碧云天有限公司;人IL-1β試劑盒(貨號(hào)BMS213HS)、人IL-18 ELISA 試劑盒(貨號(hào)KMC0181)、兔源一抗NLRP3 抗體(貨號(hào)PA5-20838)、GAPDH 抗體(貨號(hào)TAB1001),二抗羊抗兔IgG(貨號(hào)A32731)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen。MODEL550型酶標(biāo)儀、7300 RT-qPCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)等。
1.3.2 標(biāo)本采集 收集所有受試者清晨空腹外周靜脈血6 mL,分兩份保存,每份3 mL,其中一份添加淋巴細(xì)胞分離液提取PBMC,具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。另一份于室溫下3 000 r/min(有效離心半徑5 cm)離心15 min分離血清。兩份采集標(biāo)本立即送檢或置于-80 ℃冰箱保存待檢。
1.3.3 血清HBV-DNA 載量檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)檢測(cè)血清HBV-DNA載量。
1.3.4 PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 水平 采用RNA 提取試劑盒提取PBMC 總RNA,反轉(zhuǎn)錄得cDNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用RT-qPCR 法對(duì)Mir-155、NLRP3 mRNA 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系共25 μL:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)/TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)12.5 μL,cDNA(50 ng/μL)2 μL,上反向引物(10 μmol/L)各1 μL,雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)條件:95 ℃,5 s;95 ℃,30 s;60 ℃,30 s;72 ℃,15 s;40 個(gè)循環(huán);添加溶解曲線。Mir-155 正向引物序列(5′→3′)為:TTA ATG CTA ATC GTG ATA GGG GT,反向引物序列(5′→3′)為:CCT TAA AAC TCC ACT AGA AGC A;NLRP3 mRNA 正向引物序列(5′→3′)為:CGT GAG TCC CAT TAA GAT GGA GT,反向引物序列(5′→3′)為:CCC GAC AGT GGA TAT AGA ACA GA-3;內(nèi)參U6 正向引物序列(5′→3′)為:GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T,反向引物序列(5′→3′)為:CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT;GAPDH 正向引物序列(5′→3′)為:GTC GAT GGC TAG TCG TAG CAT CGA T;反向引物序列(5′→3′)為:TGC TAG CTG GCA TGC CCG ATC GAT C。 PBMC Mir-155、NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用2法進(jìn)行分析。
1.3.5
PBMC 中NLRP3 蛋白表達(dá)水平 采用免疫印跡(Western blot,WB)檢測(cè)PBMC 中NLRP3 蛋白表達(dá)。采用蛋白抽提試劑盒提取PBMC 總蛋白,BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩H∵m量蛋白樣品于80 mV 電壓下6%SDS-PAGE 電泳2 h,250 mA 下PVDF 膜轉(zhuǎn)膜70 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入適量含2%脫脂奶粉的PBS 稀釋,加NLRP3(1∶200)及健康對(duì)照GAPDH 抗體(0.5 μg/mL)4 ℃孵育過夜,TBST 緩沖液洗膜3 次,每次20 min,用適量含2%脫脂奶粉的PBS 稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育1.5 h,按上述方法洗膜,顯色,曝片,觀察并分析結(jié)果。1.3.6
血清IL-1β、IL-18 水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELLSA)檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)水平,具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以x ± s表示,兩組間比較用t 檢驗(yàn),多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA 檢驗(yàn)),進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用例(%)表示,兩兩比較采用χ檢驗(yàn)。采用Pearson 法分析PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA及其血清IL-1β、IL-18水平的相關(guān)性。P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1 CHB病人與健康對(duì)照組一般資料比較
2.1 兩組一般資料比較
兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),與健康對(duì)照組比較,CHB組血清肝功能指標(biāo)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。見表1。2.2 不同HBV-DNA載量CHB病人PBMC 中Mir
-155、NLRP3 水平比較
與HBV-DNA 低載量組比較,中、高載量組CHB 病人PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 及蛋白水平依次增加,均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。見表2,圖1。圖1 不同HBV-DNA載量CHB病人PBMC中NLRP3蛋白表達(dá)
表2 不同HBV-DNA載量CHB病人外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中Mir-155、NLRP3水平比較/x ± s
2.3 不同HBV-DNA 載量CHB 病人血清IL
-1
β、IL
-18 水平比較
與HBV-DNA 低載量組比較,中、高載量組CHB 病人血清IL-1β、IL-18 水平依次增加,與HBV-DNA 中載量組比較,高載量組CHB 病人血清IL-1β、IL-18 水平均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。見表3。表3 不同HBV-DNA載量CHB病人血清IL-1β、IL-18水平比較/(ng/L,x ± s)
2.4 PBMC 中Mir
-155、NLRP3 mRNA 水 平 與CHB 病人肝炎炎癥分級(jí)及肝纖維化分期的關(guān)系
隨肝炎炎癥分級(jí)增加、肝纖維化分期增加,PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 水平依次增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P <0.05),見表4。
2.5 CHB 病人PBMC 中Mir
-155、NLRP3 蛋白水平的相關(guān)性分析
Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示,CHB 病人PBMC 中Mir-155、NLRP3 水平呈顯著正相關(guān)(r=0.714,P <0.05)。見圖2。圖2 CHB病人外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中Mir-155、NLRP3水平的相關(guān)性
2.6 CHB病人PBMC中Mir-155、NLRP3水平與血清IL-1
β、IL-18水平相關(guān)性分析
Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,CHB 病人PBMC 中Mir-155 與血清IL-1β、IL-18水平均呈正相關(guān)(P <0.05),NLRP3水平與血清IL-1β、IL-18水平呈顯著正相關(guān)(P <0.05)。見表5。表5 CHB病人外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中Mir-155、NLRP3水平與血清IL-1β、IL-18水平相關(guān)性
CHB 是一種重大肝臟傳染性疾病,全球約20多億HBV 攜帶者,3.6 億CHB 病人,且每年約有60 萬人因HBV 相關(guān)性肝衰竭、肝硬化或肝細(xì)胞癌死亡,嚴(yán)重危害人類健康。目前臨床治療CHB 多以干擾素、核酸類等藥物為主,以靶向病毒逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域破壞HBV-DNA 合成,但HBV-DNA 感染機(jī)及發(fā)病制尚不完全清楚,因此尋找HBV-DNA 復(fù)制相關(guān)的生物分子進(jìn)行CHB 靶向治療具有重要意義。miRNA,是一類長(zhǎng)鏈非編碼小RNA,與先天性和獲得性免疫密切相關(guān),其中Mir-155 在免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Abdul-Maksoud 等研究發(fā)現(xiàn),Mir-155 與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)疾病活動(dòng)度及炎癥程度有關(guān),血清Mir-155表達(dá)水平在RA 病人中顯著高于健康對(duì)照組,且與腫瘤壞死因-α(TNF-α)、IL-1β 水平均呈正相關(guān)。Fang 等研究報(bào)道,與健康對(duì)照組比較,HBV 攜帶者及CHB 病人CD4+、CD8+T 細(xì)胞中Mir-155 水平依次升高,CHB病人PBMC 中Mir-155水平升高與T細(xì)胞活化有關(guān),是HBV 感染免疫激活疾病進(jìn)展的潛在標(biāo)志物。吳曉升等研究報(bào)道,與健康對(duì)照組比較,CHB 病人PBMC 中Mir-155 水平顯著 下 調(diào),與ALT 正 常 的CHB 病 人 比 較,ALT 升 高 的CHB 病 人PBMC 中Mir-155 水平顯著升高,且于HBV-DNA 無相關(guān)性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與健康對(duì)照組比較,CHB 病 人PBMC 中Mir-155 水 平 顯 著 升 高,隨HBV-DNA 載量增加,CHB 病人PBMC 中Mir-155 水平依次升高,且與血清IL-1β、IL-18 水平均呈正相關(guān),而IL-1β、IL-18均為IL-1家族中重要促炎因子,與Fang 等結(jié)果一致,提示Mir-155 水平升高可能與CHB 病人HBV-DNA 復(fù)制有關(guān),參與CHB 炎癥反應(yīng)。但與吳曉升等研究結(jié)果不一致,可能,因樣本量選擇差異,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
表4 外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中Mir-155、NLRP3 mRNA水平與CHB病人肝炎炎癥分級(jí)及肝纖維化分期的關(guān)系/x ± s
炎性小體由多種分子共同構(gòu)成的高分子質(zhì)量、多蛋白復(fù)合體,在固有免疫中其重要作用,目前已發(fā)現(xiàn)NLRP1、NLRP3、黑色素瘤缺失基因2 及ICE 蛋白酶激活因子4 中炎性小體,其中NLRP3 目前研究最多,結(jié)構(gòu)和功能最為明確。研究報(bào)道,HBV 表達(dá)的HBx蛋白可上調(diào)NLRP3炎性小體表達(dá),NLRP3激活后可刺激半胱天冬氨酸氨基酶-1 前提剪切活化為具有酶活性的Caspase-1,進(jìn)而促進(jìn)IL-1β、IL-18等促炎因子成熟并釋放至胞外參與機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)。何子凡等研究報(bào)道,NLRP3 炎癥小體參與慢性阻塞性肺疾?。璺危┎∪搜装Y反應(yīng),與健康對(duì)照組比較,穩(wěn)定期、急性加重期慢阻肺病人PBMC 中NLRP3 mRNA、IL-1β、IL-18 水平依次增高。張任飛等研究報(bào)道,與正常組、單純2 型糖尿?。═2DM)組、單純慢性牙周炎(CP)組比較,T2DM合并CP 組 病 人 血 清NLRP3、Caspase-1 mRNA 及IL-1β 水平顯著升高,且呈正相關(guān),提示NLRP3 及IL-1β 可促進(jìn)T2DM 合并CP 病人炎癥反應(yīng),與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),CHB 病人PMBC中NLRP3 mRNA 及蛋白水平隨HBV-DNA 載量增加而升高,均高于健康對(duì)照組,且與Mir-155 及血清IL-1β、IL-18 水平均呈正相關(guān),與何子凡等、張任飛等研究結(jié)果一致。而陳洪濤等研究報(bào)道,與健康對(duì)照組比較,CHB 病人PBMC 中NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,干擾素誘導(dǎo)蛋白16(IFI16)炎癥小體水平顯著升高,且于HBV-DNA 載量呈正相關(guān),與本研究結(jié)果不一致,可能因樣本量選擇不同或CHB 病人HBV-DNA 感染過程中存在其他炎性小體共同參與。另本研究發(fā)現(xiàn)Mir-155、NLRP3 mRNA 水平與肝炎癥分級(jí)及肝纖維分期有關(guān),綜合以上研究結(jié)果及本研究結(jié)果提示,Mir-155 可 能 協(xié) 同NLRP3 與CHB 病 人HBVDNA 復(fù)制有關(guān),促進(jìn)CHB 病人炎癥反應(yīng),有待進(jìn)一步深入探究。