吳振奎,鐘麗花,林則彬,王家文
作者單位:1海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院兒科,海南 ???71100;
2海南省兒童醫(yī)院兒科,海南 海口571100
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原體之一。臨床表現(xiàn)為高熱、呼吸困難等癥狀,可引起肺炎、毛細支氣管炎,尤其是肺炎,嚴重影響嬰幼兒身心健康成長。因此,探討與RSV 下呼吸道感染肺炎發(fā)病相關因子具有重要臨床意義。T 淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8、CD4/CD8等在發(fā)揮免疫功能及維持免疫平衡中起關鍵作用,研究發(fā)現(xiàn)T 淋巴細胞免疫功能失調(diào)參與RSV 下呼吸道感染肺炎病情進展。而微小RNA-145(MicroRNA-145,mir-145)是目前呼吸系統(tǒng)疾病中研究較多的微小RNA(MicroRNA,miRNA)家族成員之一,其水平異常變化在機體免疫反應中發(fā)揮至關重要的作用,參與多種疾病發(fā)生、發(fā)展。但mir-145 與RSV 下呼吸道感染肺炎發(fā)病及其T淋巴細胞亞群的關系尚不十分明確。鑒于此,本研究通過檢測RSV 下呼吸道感染肺炎病兒外周血血漿中mir-145表達,分析其與外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中T淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8水平及CD4/CD8值關系,以期為臨床治療RSV 下呼吸道感染肺炎提供新思路。結(jié)果如下。
1.1 一般資料
選取2017 年1月至2018 年12 月海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院兒科收治的RSV 下呼吸道感染肺炎病兒126 例作為RSV 肺炎組。入選標準:①均符合RSV 下呼吸道感染肺炎相關診斷標準;②RSV 檢測陽性;③均為急性發(fā)?。虎芘R床資料完整齊全。排除標準:①合并支氣管哮喘、肺結(jié)核等其他呼吸系統(tǒng)疾病;②入組前接受糖皮質(zhì)激素類或抗菌藥物治療;③伴有喉軟骨及肺發(fā)育不良;④合并先天性心臟病。RSV肺炎組病兒男性69例、女性57例,年齡(9.87±3.28)月,年齡范圍為30 d至15個月。另選取同期在海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院進行體檢的健康兒童130例作為健康對照組,心肺無異常,且無呼吸道感染病史,其中男性71 例、女性59 例,年齡(10.24±3.40)月,年齡范圍為30 d 至15 月。RSV 肺炎組病兒根據(jù)病情嚴重程度分為輕度組(n=54)、重度組(n=72),其中輕度組男性30 例、女性24 例,年齡(9.68±3.17)月,年齡范圍為30 d 至14 月;重度組男性39 例、女性33 例,年齡(9.94±3.20)月,年齡范圍為30 d 至15 月。并依據(jù)重度組病兒是否給予機械通氣分為非機械通氣組(n = 38)、機械通氣組(n=34),其中非機械通氣組男性21 例、女性17 例,年齡(9.73±3.22)月,年齡范圍為30 d~15 月;機械通氣組男性18 例、女性16 例,年齡(9.50±3.14)月,年齡范圍為30 d至15月。病兒近親屬均簽署《知情同意書》。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。同時,健康對照組與RSV 肺炎組、輕度組與重度組、非機械通氣組與機械通氣組基本資料相比,均差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。見表1~3。表1 健康對照組與呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎組基線資料比較
表2 呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎輕度組與重度組基線資料比較
1.2 方法
1.2.1 標本收集 分別抽取健康對照組和RSV 肺炎組病兒外周靜脈血4 mL。取2 mL 使用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K)抗凝,室溫靜置30 min 后離心(3 000 r/min)10 min,分離獲取血漿,并儲存于-80 ℃低溫環(huán)境中,用于檢測血漿mir-145 表達水平。另2 mL EDTA-K抗凝后,使用Ficoll-Hypaque分離液(購自無錫華精生物科技有限公司)分離提取PBMC,用于檢測T 淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8水平及CD4/CD8值。
表3 重度呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎非機械通氣組與機械通氣組基線資料比較
1.2.2
血漿mir-145 表達水平檢測 利用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測血漿mir-145表達水平。按照Trizol試劑盒(購自沈陽萬類生物科技有限公司)說明書提取血漿中總RNA,并依據(jù)PrimeScriptRT試劑盒(購自杭州主諾生物技術有限公司)中方法合成cDNA 鏈。以U6 為mir-145內(nèi)參進行擴增,引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。mir-145正向引物為5′-CCTCACGGTCCAGTTTTCCC-3′,反向引物為5′-GCAAATCCAGCTGTGAAACCA-3′;內(nèi)參U6正向引物為5′-GTGGCTTCGGCAGCACATATACT-3′,反向引物為5′-GTAACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。反應條件為:95 ℃預變性3 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,共40個循環(huán)。所有反應均重復3次,完成后獲得Ct平均值,并用2計算血漿mir-145相對表達量。1.2.3
PBMC 中T 淋巴細胞亞群檢測 使用BD FACSCalibur型流式細胞儀及配套試劑盒(購自北京德利卡生物技術有限公司)檢測PBMC 中T 淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8水平,并用MRFlow 流式細胞分析軟件自動行CD3、CD4、CD8絕對計數(shù),同時計算CD4/CD8值。1.3 統(tǒng)計學方法
運用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用率(%)進行統(tǒng)計描述,行χ檢驗;計量資料(血漿mir-145 表達及PBMC 中CD3水平等)均符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗,采用x ± s 進行統(tǒng)計描述,行t 檢驗。采用Pearson 檢驗分析RSV 肺炎病兒血漿mir-145 表達與PBMC 中T淋巴細胞亞群水平的相關關系。P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。2.1 健康對照組與RSV 肺炎組血漿mir
-145 表達及PBMC 中T 淋巴細胞亞群水平比較
RSV 肺炎組病兒血漿mir-145 表達及PBMC 中CD8水平均明顯高于健康對照組(P <0.05),PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均顯著低于健康對照組(P <0.05)。見表4。2.2 不同程度RSV 肺炎病兒血漿mir
-145 表達及PBMC 中T 淋巴細胞亞群水平比較
重度組病兒血漿mir-145 表達及PBMC 中CD8水平均顯著高于輕度組病兒(P <0.05),PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均明顯低于輕度組病兒(P <0.05)。見表5。2.3 重度RSV肺炎非機械通氣組與機械通氣組病兒血漿mir-145 表達及PBMC 中T 淋巴細胞亞群水平比較
重度RSV肺炎機械通氣組病兒血漿mir-145表達及PBMC中CD8水平均明顯高于非機械通氣組病兒(P <0.05),PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均顯著低于非機械通氣組病兒(P <0.05)。見表6。表4 健康對照組與呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎組血漿微小RNA-145(mir-145)表達及外周血單個核細胞(PBMC)中T淋巴細胞亞群水平比較/x ± s
表5 不同程度呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎病兒血漿微小RNA-145(mir-145)表達及外周血單個核細胞(PBMC)中T淋巴細胞亞群水平比較/x ± s
表6 重度呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎非機械通氣組與機械通氣組病兒血漿微小RNA-145(mir-145)表達及外周血單個核細胞(PBMC)中T淋巴細胞亞群水平比較/x ± s
2.4 RSV 肺炎病兒血漿mir
-145 表達與PBMC 中T 淋巴細胞亞群水平的相關性
RSV 肺炎病兒血漿mir-145 表達與PBMC 中CD3水平呈負相關(r = -0.594,P <0.05),與PBMC 中CD4水平呈負相關(r-0.620,P <0.05),與PBMC 中CD8水平呈正相關(r0.657,P <0.05),與CD4/CD8值呈負相關(r = -0.633,P <0.05)。見圖1。近年來,因RSV 引起下呼吸道感染肺炎住院的嬰幼兒越來越多,若治療不及時,易發(fā)展為重癥肺炎,甚至可導致心力衰竭,危及病兒生命安全。因此尋找用于早期判斷RSV 下呼吸道感染肺炎病情程度的生物標記物至關重要。本研究選取外周血血漿中mir-145作為觀察項目,探討其與T 淋巴細胞亞群的關系,以期為早期防治RSV 下呼吸道感染肺炎提供有力依據(jù)。
圖1 呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎病兒血漿微小RNA-145(mir-145)表達與外周血單個核細胞(PBMC)中T淋巴細胞亞群水平的相關性
miRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA分子,可通過降解靶基因mRNA 或抑制其翻譯,參與免疫反應調(diào)控等一系列過程。研究證實,miRNA 在多種呼吸系統(tǒng)疾病中起重要作用,如mir-145。mir-145是一種高度保守的miRNA,定位于人染色體5q32-33,其在T 淋巴細胞生成、發(fā)育中起重要調(diào)控作用。Qiu等研究報道,哮喘發(fā)病與淋巴細胞中輔助性T 細胞1(T helper cell 1,Th1)/輔助性T 細胞2(T helper cell 2,Th2)的平衡密切相關。且Fan 等研究發(fā)現(xiàn),外周血mir-145 表達水平可通過靶向哮喘患者Runt 相關轉(zhuǎn)錄因子3(Runt-related transcription factor 3,Runx3)調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡,可作為診斷和治療哮喘的生物標志物。T 淋巴細胞是維持機體正常免疫功能的重要亞群,可分為CD4、CD8兩大亞群,CD4細胞活化后主要分為Th1、Th2 兩種類型,而Th1/Th2 平衡失調(diào)在肺炎發(fā)病過程中具有重要意義。CD3可用于評估細胞免疫的總體水平,CD4/CD8值可反映機體免疫穩(wěn)態(tài)情況。正常情況下,T 淋巴細胞亞群間相互作用,穩(wěn)定調(diào)節(jié)機體免疫功能。徐暢等研究發(fā)現(xiàn),外周血CD3、CD4、CD8 水平及CD4/CD8 值變化與哮喘病兒過敏原類型有關,在哮喘發(fā)病過程中起重要作用。游正銘研究報道,監(jiān)測重癥肺炎患者淋巴細胞亞群(CD3等)水平,有利于臨床治療重癥肺炎和判斷預后。此外,梁導艷等研究發(fā)現(xiàn),支原體肺炎病兒CD3水平、CD4/CD8 值遠低于健康對照組,可作為反映免疫功能狀態(tài)的有效指標。
本研究中,RSV肺炎組病兒血漿mir-145表達及PBMC 中CD8水平均遠高于健康對照組,PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均遠低于健康對照組,與梁導艷等研究結(jié)果類似,提示外周血血漿中mir-145 表達及PBMC 中T 淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8水平、CD4/CD8值異常可能與RSV 下呼吸道感染肺炎發(fā)病有關。進一步研究發(fā)現(xiàn),重度組病兒血漿mir-145 表達及PBMC 中CD8水平均遠高于輕度組病兒,PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均遠低于輕度組病兒,提示外周血血漿中mir-145 表達異常升高及T 淋巴細胞亞群異常可能參與RSV 下呼吸道感染肺炎病兒病情進展。本研究還發(fā)現(xiàn),重度RSV 肺炎機械通氣組病兒血漿mir-145 表達及PBMC 中CD8水平均遠高于非機械通氣組病兒,PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均遠低于非機械通氣組病兒,提示臨床通過監(jiān)測上述參數(shù)變化,可能有利于評估RSV 下呼吸道感染肺炎病兒病情嚴重程度,對早期治療RSV 下呼吸道感染肺炎具有臨床意義。此外,本研究Pearson檢驗分析發(fā) 現(xiàn),RSV 肺 炎病 兒血 漿mir-145 表 達與PBMC 中CD3水平呈負相關,與PBMC 中CD4水平呈負相關,與PBMC 中CD8水平呈正相關,與CD4/CD8值呈負相關,推測外周血血漿中mir-145表達參與RSV下呼吸道感染肺炎發(fā)生、發(fā)展,可能與PBMC 中T 淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8水平及CD4/CD8值異常變化有關。
綜上所述,外周血血漿中mir-145 表達水平在RSV 下呼吸道感染肺炎病兒中明顯升高,其水平變化可能與T 淋巴細胞亞群CD8水平異常升高,CD3、CD4水平及CD4/CD8值異常降低有關,提示監(jiān)測上述參數(shù)變化可能有助于早期防治RSV 下呼吸道感染肺炎。本研究僅初步探討RSV 下呼吸道感染肺炎病兒外周血血漿中mir-145 表達與T 淋巴細胞亞群的關系,下一步應增加樣本繼續(xù)進行研究。