王靜怡，高娟娟，王彤歌

作者單位：1漢中市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 漢中723000；

2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州510632

缺血性腦卒中屬于臨床常見的一類缺血性腦血管病，發(fā)病率、致殘率和致死率均較高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)急性缺血性腦卒中年標(biāo)準(zhǔn)化患病率約為1 114.8/10 萬，病死率約為114.8/10 萬，且目前該病的患病率與病死率仍呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。對(duì)于缺血性腦卒中病人，目前臨床醫(yī)師多主張?jiān)跁r(shí)間窗內(nèi)給予血管再通治療，包括溶栓、機(jī)械取栓等，并配合給予抗凝、降低顱內(nèi)壓、營(yíng)養(yǎng)腦神經(jīng)等支持治療，可減輕腦組織損傷，改善預(yù)后，但仍有部分病例遺留有不同程度的偏癱、認(rèn)知障礙、失語、吞咽功能障礙等，且死亡率仍需進(jìn)一步控制。氧化應(yīng)激反應(yīng)是缺血性腦卒中研究的熱點(diǎn)，也是該病發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制，以往報(bào)道顯示缺血性腦卒中腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷受沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）/核因子相關(guān)因子2（Nrf2）通路調(diào)控，可作為治療的作用靶點(diǎn)。研究指出，在缺血性腦卒中發(fā)病后由于局部缺血缺氧可損傷神經(jīng)元所支配的機(jī)體功能。丁基苯酞是從芹菜油中提取的化學(xué)成分之一，可治療高血壓，且具有神經(jīng)保護(hù)作用，且在既往報(bào)道中證實(shí)該藥物具有抗老年小鼠腦組織氧化能力，但是該藥物是否能夠調(diào)控SIRT1/Nrf2通路控制缺血性腦卒中病人的氧化應(yīng)激損傷尚鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究自2018 年3 月至2019 年3 月選取50 只成年雄性SD大鼠設(shè)計(jì)如下對(duì)照實(shí)驗(yàn)，旨在深入探討上述問題，挖掘丁基苯酞的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

50 只成年雄性SD 大鼠，均健康，7～9 周齡，體質(zhì)量（220±20）g，SPF 級(jí)，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（豫）20180005。本研究中對(duì)于大鼠的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑及設(shè)備

丁基苯酞（購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠，純度≥98%）；無菌生理鹽水（購(gòu)自杭州四季青生物有限公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自艾美捷科技有限公司）；細(xì)胞裂解液（購(gòu)自上海生物工程技術(shù)公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液（購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司）；二奎啉甲酸法（BCA）蛋白定量試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Hyclone Pierce 公司）；病毒核酸提取法（Trizol）試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司）；兔抗鼠沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）、核因子相關(guān)因子2（Nrf2）單克隆抗體（一抗，放大倍數(shù)：1∶1 000），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔SIRT1、Nrf2 多克隆抗體（二抗，放大倍數(shù)：1∶5 000）（購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司）。

XSZ-H 型光學(xué)顯微鏡（購(gòu)自重慶光學(xué)儀器廠）；L500 型臺(tái)式離心機(jī)（購(gòu)自上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）；NVSLM1 型組織切片機(jī)（購(gòu)自美國(guó)WPI 公司）；680型酶標(biāo)儀（購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司）；722N型分光光度計(jì)（購(gòu)自河南兄弟儀器設(shè)備有限公司）；7300 型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（購(gòu)自美國(guó)ABI 公司）；PowerPro3AMP型電泳儀（購(gòu)自通用實(shí)驗(yàn)科技有限公司）。

1.3 方法

分組、建模及干預(yù)方法：50 只成年雄性SD大鼠被采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和低、中、高劑量組，各10 只。建模方法：腹腔注射350 mg/kg 水合氯醛（10%），仰臥位固定，做頸部正中切口，依次游離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)外動(dòng)脈，電凝頸內(nèi)外動(dòng)脈的交通支，結(jié)扎遠(yuǎn)心端。在結(jié)扎部位下端剪一個(gè)小口穿入尼龍線，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入，直至大腦中動(dòng)脈起始部，長(zhǎng)度約為18.5 cm。建模大鼠蘇醒后若出現(xiàn)Horner 征則認(rèn)為建模成功。假手術(shù)組同上做切口、游離，無尼龍線結(jié)扎操作。建模成功后低、中、高劑量組分別給予40、80、160 mg/kg 丁基苯酞腹腔注射，余兩組均給予等量生理鹽水腹腔注射，1次/24小時(shí)，持續(xù)72 h。

神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià)：采用Zea Longa 標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)，共4分，評(píng)分越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

腦皮質(zhì)組織病理改變觀察：采用HE 染色。給藥結(jié)束后深度麻醉，多聚甲醛活體灌注，斷頭取腦，取缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織Barrel 腦區(qū)常規(guī)以4%多聚甲醛固定，包埋、切片、HE染色、光學(xué)顯微鏡觀察。

缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織MDA、SOD、GSH-PX 的活性檢測(cè)：采用化學(xué)比色法。取腦皮質(zhì)組織，與預(yù)冷的生理鹽水一同勻漿，生理鹽水體積總量是組織塊的9 倍，充分勻漿化，3 600 r/min 離心15 min，留取上清，按照試劑盒說明書操作，并以酶標(biāo)儀測(cè)定470 nm 處波長(zhǎng)的光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定上述蛋白活性。

缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織SIRT1、Nrf2 mRNA 表達(dá)檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)PCR（qRT-PCR）檢測(cè)。常規(guī)取腦皮質(zhì)組織勻漿后以Trizol 試劑盒采用一步法提取總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照基因庫信息設(shè)計(jì)SIRT1、Nrf2、β-actin（內(nèi)參）上下游引物序列，并委托寶生物（大連）科技有限公司合成。長(zhǎng)度均為20 bp。配置反應(yīng)體系，PCR 擴(kuò)增，條件：94 ℃30 s，30 個(gè)循環(huán)：54 ℃30 s，72 ℃45 s，60 ℃90 s，最后72 ℃5 min。室溫冷卻，電泳并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行掃描，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，即2。

缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織SIRT1、Nrf2 蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)。常規(guī)取腦皮質(zhì)組織勻漿、裂解、蛋白定量。加入上樣緩沖液，加熱變性處理，電泳，轉(zhuǎn)膜，以脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗室溫孵育，過夜。洗膜后加入二抗，37 ℃孵育1 h，顯影成像，用Image-Pro Plus 軟件掃描圖像的目的條帶，分析其灰度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以x ± s描述，多樣本間比較以單因素方差分析，其中的每?jī)蓸颖鹃g比較以SNK-q檢驗(yàn)，組內(nèi)治療前后比較以配對(duì)t 檢驗(yàn)；若計(jì)量資料不符合正態(tài)分布或方差不齊，則采用秩和檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià)比較

建模和給藥期間模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組分別有3只、3 只、2 只、1 只死亡，剔除。給藥前后與假手術(shù)組比較，其余4 組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均升高（P ＜0.05），且給藥前模型組、3 劑量組中每?jī)山M比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；給藥后模型組評(píng)分明顯高于給藥前（P ＜0.05），3 劑量組評(píng)分均明顯降低（P ＜0.05）；給藥后3 劑量組評(píng)分均低于模型組（P ＜0.05），中劑量組和高劑量組評(píng)分均低于低劑量組（P ＜0.05），高劑量組評(píng)分低于中劑量組（P ＜0.05），見表1。

2.2 各組腦組織病理學(xué)觀察

假手術(shù)組腦皮質(zhì)神經(jīng)元飽滿、結(jié)構(gòu)正常、核大且圓，常染色質(zhì)均勻分布，膜結(jié)構(gòu)清晰，核糖體豐富；模型組腦皮質(zhì)神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)壞死、溶解，細(xì)胞膜/核膜斷裂，神經(jīng)元崩解，結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞核皺縮；低劑量組腦皮質(zhì)神經(jīng)組織部分結(jié)構(gòu)壞死、溶解，部分細(xì)胞膜/核膜斷裂，核尚完整，膜結(jié)構(gòu)不清，殘存的線粒體嵴斷裂空泡化；中劑量組腦皮質(zhì)神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)輕度溶解，核不規(guī)則，核仁明顯偏向一側(cè)，可見明顯核袋，染色質(zhì)較密集，膜結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞質(zhì)致密，少部分線粒體嵴斷裂；高劑量組腦皮質(zhì)神經(jīng)組織基本正常，多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞規(guī)則，核大，仍有部分神經(jīng)元核仁偏位，可見少量異染色質(zhì)，常染色質(zhì)較均勻，膜結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，極少量線粒體仍可見嵴斷裂。見圖1。

表1 缺血性腦卒中大鼠各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較/（分，±s）

2.3 各組腦皮質(zhì)組織MDA、SOD、GSH-PX 的活性比較

各組腦皮質(zhì)組織MDA、SOD、GSH-PX 的活性比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），與假手術(shù)組比較，其余4組MDA的活性均升高（P ＜0.05），SOD、GSH-PX 的活性均降低（P ＜0.05）；與模型組比較，3劑量組MDA 的活性均降低（P ＜0.05），SOD、GSHPX的活性均升高（P ＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和中劑量組MDA 的活性均降低（P ＜0.05），SOD、GSH-PX的活性均升高（P ＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組MDA 的活性降低（P ＜0.05），SOD、GSH-PX的活性均升高（P ＜0.05），見表2。

表2 缺血性腦卒中大鼠各組腦皮質(zhì)組織MDA、SOD、GSH-PX的活性比較/±s

2.4 各組腦皮質(zhì)組織SIRT1、Nrf2 mRNA 表達(dá)比較

各組腦皮質(zhì)組織SIRT1、Nrf2 mRNA 表達(dá)比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），與假手術(shù)組比較，其余4組SIRT1、Nrf2 mRNA 表達(dá)均下降（P ＜0.05）；與模型組比較，3 劑量組SIRT1、Nrf2 mRNA 表達(dá)均升高（P ＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組SIRT1、Nrf2 mRNA 表達(dá)均升高（P ＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組SIRT1、Nrf2 mRNA 表達(dá)均升高（P ＜0.05），見表3。

表3 缺血性腦卒中大鼠各組腦皮質(zhì)組織SIRT1、Nrf2 mRNA表達(dá)比較/±s

2.5 各組腦皮質(zhì)組織SIRT1、Nrf2 蛋白表達(dá)比較

各組腦皮質(zhì)組織SIRT1、Nrf2 蛋白表達(dá)比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），與假手術(shù)組比較，其余4組SIRT1、Nrf2 蛋白表達(dá)均下降（P ＜0.05）；與模型組比較，3 劑量組SIRT1、Nrf2 蛋白表達(dá)均升高（P ＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組SIRT1、Nrf2 蛋白表達(dá)均升高（P ＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組SIRT1、Nrf2 蛋白表達(dá)均升高（P ＜0.05），見表4，圖2。

表4 缺血性腦卒中大鼠各組腦皮質(zhì)組織SIRT1、Nrf2 蛋白表達(dá)比較/±s

圖2 腦皮質(zhì)組織沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）、核因子相關(guān)因子2（Nrf2）蛋白蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)

3 討論

氧化應(yīng)激是缺血性腦卒中病人局部腦組織損傷的主要作用因素，從動(dòng)脈粥樣硬化啟動(dòng)的中心環(huán)節(jié)，即低密度脂蛋白氧化成為氧化型低密度脂蛋白便發(fā)揮著重要的作用，直至腦卒中發(fā)生后基質(zhì)金屬蛋白酶被激活、血腦屏障被破壞、神經(jīng)元變性凋亡等過程，氧化應(yīng)激均是其中重要的機(jī)制。有研究指出，在缺血性腦卒中病人中由于氧化應(yīng)激反應(yīng)的存在不僅可影響神經(jīng)元的恢復(fù)，還可影響預(yù)后，危害極大。國(guó)外報(bào)道表明，氧化應(yīng)激在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、缺血性腦卒中和腦損傷后側(cè)支循環(huán)建立等代償機(jī)制中均有參與，而抗氧化應(yīng)激已成為缺血性腦卒中臨床防治的重點(diǎn)。但目前臨床常用的藥物抗氧化應(yīng)激作用均不甚理想，而丁基苯酞在缺血性腦卒中治療中顯示出良好的價(jià)值，故本研究特嘗試探討該藥物是否對(duì)缺血性腦卒中有抗氧化應(yīng)激作用，并初步探討其機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，給藥后3 劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均下降，模型組則升高，且3劑量組的作用效果呈劑量依賴性，可知丁基苯酞有助于減輕缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能缺損程度，且高劑量丁基苯酞的效果最佳。在腦組織病理學(xué)觀察結(jié)果中顯示，假手術(shù)組均正常，模型組呈嚴(yán)重病理改變，3 劑量組病理改變均有所減輕，且高劑量組與假手術(shù)組最為接近，提示丁基苯酞有助于減輕缺血性腦卒中大鼠腦皮質(zhì)病理改變，且高劑量藥物的效果最佳。丁基苯酞是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制的一種抗腦缺血藥物，可通過改善缺血腦能量代謝、縮小腦梗死面積、減輕神經(jīng)功能缺損發(fā)揮治療作用。此外，丁基苯酞還可減輕局部腦缺血所致的腦水腫，促進(jìn)腦血流恢復(fù)，改善軟腦膜微循環(huán)，減輕卒中發(fā)生后的神經(jīng)病理癥狀。本研究結(jié)果中，3 劑量組腦皮質(zhì)組織MDA、SOD、GSH-PX 的活性均較模型組顯著改善，且高劑量組均接近假手術(shù)組，可知丁基苯酞的應(yīng)用有助于改善腦皮質(zhì)組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。MDA 是在自由基作用下不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度，還可據(jù)此了解細(xì)胞損傷程度。SOD和GSH-PX 則是內(nèi)源性抗氧化酶，可清除自由基，保證細(xì)胞免受損傷，其活力可反應(yīng)機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力。在缺血性腦卒中發(fā)生后MDA 的活性顯著增強(qiáng)，而SOD 和GSH-PX 的活性則顯著降低，導(dǎo)致線粒體自身結(jié)構(gòu)與功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，誘發(fā)腦組織損傷和神經(jīng)功能缺損。有研究顯示，左旋丁基苯酞可改善血管性癡呆大鼠模型的神經(jīng)功能，減輕線粒體氧化應(yīng)激水平，與本研究結(jié)果相符，表明丁基苯酞很可能具有抗氧化應(yīng)激作用。結(jié)合上述分析，推測(cè)該藥物可能是通過改善局部能量代謝和微循環(huán)等途徑間接減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)的。

此外，本研究中3 劑量組腦皮質(zhì)組織SIRT1、Nrf2 mRNA 及蛋白表達(dá)均明顯低于假手術(shù)組，均明顯高于模型組，且3 劑量組中高劑量組SIRT1、Nrf2 mRNA及蛋白表達(dá)最高，中劑量組次之，低劑量組最低，表明丁基苯酞在缺血性腦卒中大鼠中應(yīng)用有助于上調(diào)SIRT1、Nrf2 mRNA 及蛋白表達(dá)，且高劑量丁基苯酞的作用最強(qiáng)。SIRT1 是一種與細(xì)胞分化、衰老、凋亡以及能量代謝等密切相關(guān)的組蛋白去乙酰化酶，具有氧化態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴性，在腦組織、心臟組織中分布較多，在缺血性腦卒中發(fā)生后其表達(dá)水平下降，機(jī)體抗氧化應(yīng)激損傷作用較弱，腦皮質(zhì)組織線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈，誘導(dǎo)神經(jīng)功能缺損。Nrf2在外來刺激作用下可阻遏蛋白Keap1 解離，還可結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件啟動(dòng)多種抗氧化蛋白類基因的表達(dá)，達(dá)到控制氧化應(yīng)激損傷的目的。在缺血性腦卒中發(fā)生后，Nrf2 表達(dá)下降，提示腦組織的抗氧化能力減弱，可進(jìn)一步導(dǎo)致自由基代謝失去平衡，引發(fā)腦組織損傷和神經(jīng)功能缺損，與此同時(shí)SOD、GSH-PX 的活性，而MDA 活性增強(qiáng)。因此在缺血性腦卒中治療時(shí)可通過調(diào)控SIRT1/Nrf2通路上調(diào)二者的基因與蛋白表達(dá)改善MDA、SOD、GSH-PX 的活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)所致的腦組織損傷。 本研究對(duì)缺血性腦卒中大鼠模型基于丁基苯酞后發(fā)現(xiàn)SIRT1、Nrf2 mRNA及蛋白表達(dá)相較于假手術(shù)組均明顯降低，而相較于模型組均明顯升高，可知丁基苯酞可能上調(diào)SIRT1、Nrf2 mRNA 及蛋白表達(dá)從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用的，且其作用呈劑量依賴性。

綜上所述，丁基苯酞可改善缺血性腦卒中大鼠模型的神經(jīng)功能，減輕腦皮質(zhì)組織病理改變，調(diào)節(jié)腦皮質(zhì)組織MDA、SOD、GSH-PX 等氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)的活性，推測(cè)是通過調(diào)控SIRT1/Nrf2 通路上調(diào)SIRT1、Nrf2 mRNA 及蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，且呈劑量依賴性。本研究顯示丁基苯酞具有抗缺血性腦卒中氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，并初步探討了其作用機(jī)制，為其推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，但氧化應(yīng)激反應(yīng)是復(fù)雜的生理病理過程，該藥物抗氧化應(yīng)激反應(yīng)是否具有其它作用機(jī)制仍需深入探討。

（本文圖1見插圖2-1）