湯建，趙康琦，張騰騰，申金田，聞崇煒*

(1.亳州學院中藥學院，安徽 亳州 236800；2.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

中藥白芷為傘形科植物白芷[Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f.]或杭白芷[Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f. var. formosana(Boiss.)Shan et Yuan]的干燥根，可用于解表散寒、祛風止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿[1]。主流商品藥材以川白芷、杭白芷、祁白芷、禹白芷為主[2]。

白芷的主要化學成分包括香豆素、揮發(fā)油以及甾醇類化合物等。其中揮發(fā)油的含量約占0.13%(以提取得率計)，在藥品、護膚品、香料等方面的開發(fā)和利用均具有較好的市場潛力。在一系列的活性研究中發(fā)現(xiàn)白芷揮發(fā)油具有良好的鎮(zhèn)痛、抑制酪氨酸酶、抗氧化和抗過敏等生物活性[3-6]。其中抗炎鎮(zhèn)痛活性與白芷藥材的臨床應用一致,但由于揮發(fā)性成分分離鑒定具有一定的難度，一般是作為揮發(fā)油部位(粗提取)來進行研究，尚未對白芷揮發(fā)油部位物質基礎進行細致的藥理活性研究，其作用機制尚不清楚。

目前，采用計算機軟件進行分子對接(Molecular Docking)，虛擬篩選活性部位的有效成分和潛在的相關蛋白，進而進行藥理實驗確證是一種高效的途徑，這一策略已經成為一種有效地探索中藥活性成分及其作用機制的途徑。分子對接是利用計算機技術模擬分子的幾何匹配和能量匹配，來尋找小分子配體(化合物)與大分子生物受體(靶點)之間活性位點的最佳結合模式的過程[7-8]。針對某一特定的靶點，利用相關軟件對化合物進行對接，虛擬篩選出的化合物再進一步進行生物活性檢測，最終確定活性成分，該技術在中藥有效物質基礎研究方面有著廣泛的應用前景。目前常用的軟件有AutoDock、MOE、Sybyl、eHiTS和Molegro Virtual Docker等[8]。

本研究中根據前期實驗數(shù)據[6,9-14]選取κ阿片受體等18個蛋白為對接靶點蛋白，采用AutoDock Vina軟件，與檢索到的17個化合物進行分子對接，虛擬篩選白芷揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛活性成分，初步確定潛在的關鍵結合蛋白，為進一步探討白芷抗炎鎮(zhèn)痛機制提供一定的科學依據。

1 材料

本研究采用AutoDock Tools1.5.6和AutoDock Vina(美國The Scripps Research Institute)，PyMOL(TM) 1.7.4.5 Edu(美國Schrodinger, LLC公司)和Discovery Studio 2016 client(美國BIOVIA公司)。

2 方法

2.1 白芷揮發(fā)油中化學成分的收集

檢索國內外關于中藥白芷的文獻，共收集到含量較為豐富的17個小分子化合物(按結構類型和含量排序)：十二烷醇(dodecanol，1)、十三烷醇(tridecanal，2)、十四烷醇(tetradecanol，3)、2-甲基-2-己醇(2-methyl-hexan-2-ol，4)、1-十六烯(1-hexadecene，5)、E-3-十二碳烯(E-3-eicosene，6)、E-9-十八碳烯(E-9-octadecene，7)、甲基環(huán)癸烷(methylcyclodecane，8)、1,4-環(huán)壬二烯(1,4-cyclononadiene，9)、環(huán)十二烷(cyclododecane，10)、環(huán)十四烷(cyclotetradecane，11)、2-羥基環(huán)十五烷酮(2-hydroxycyclopentadecanone，12)、4-萜烯醇(4-terpinenol，13)、1-α-松油醇(1-α-terpinenol，14)、α-蒎烯(α-pinene，15)、β-石竹烯(β-caryophyllene，16)、蛇麻烯(又稱葎草烯或α-石竹烯，α-humulene，17)。主要為脂肪烴、脂肪醇、單萜、倍半萜等化合物(見圖1，括號內為單一成分質量占揮發(fā)油部位百分比)。化合物三維結構經MM2力場進行最小能量優(yōu)化后保存為mol2格式。AutoDock Tools1.5.6對小分子進行加氫，計算Gasteiger電荷，合并非極性氫，結果保存為pdb格式，再轉化成pdbqt格式，以備AutoDock Vina進行分子對接。

圖1 白芷揮發(fā)油中的主要化學成分結構式(括號內為質量百分比)

2.2 靶標蛋白結構的獲取和預處理

通過檢索搜索PDB結構數(shù)據庫(http://www.rcsb.org)，獲取18個靶點蛋白，見表1，將這些蛋白依次導入AutoDock Tools1.5.6中，刪除原配體，水分子，加氫，保存為pdbqt格式，以備AutoDock Vina進行分子對接。

表1 抗炎鎮(zhèn)痛相關靶點蛋白

2.3 分子對接

首先將靶點蛋白晶體復合物中配體取出，然后利用AutoDock Vina將配體分子與受體重新對接，其打分值為閾值。均方根偏差(RMSD)在2范圍內，能夠用于虛擬篩選。AutoDock Vina采用的是半柔性格點對接，指化合物對接蛋白質前要計算化合物中每種原子和受體結合區(qū)域之間的相互作用能量。對接過程中，對17個小分子化合物每個分別進行20次對接，其他參數(shù)均為缺省值。對接打分，得到17個化合物與18個靶點蛋白對接后的能量值，將能量值優(yōu)于或接近該閾值的化合物認定為白芷揮發(fā)油中基于靶點的抗炎鎮(zhèn)痛活性成分。

將蛋白導入AutoDock Tools1.5.6中，刪除原配體和水分子，加氫，保存為pdbqt格式。以備Vina進行分子對接。將蛋白晶體復合物中配體取出，利用Vina將其與受體重新對接，其結合能分值為閾值。分子對接的中心的設置見表2，對接空間(Grid Box)設置為：30 mm×30 mm×30 mm，能量范圍為4。利用Vina軟件進行半柔性對接，得到對接后能量值。將能量值優(yōu)于或接近閾值的化合物認定為中藥白芷揮發(fā)油鎮(zhèn)痛活性成分。

3 結果

3.1 分子對接的結果

從表2的對接打分值(結合能)可以看出，鏈狀脂肪烴(醇)(1、2、4、5、6、7)在分子對接中所得的結合常數(shù)較環(huán)狀脂肪烴及類似物(8、9、10、11、12)和萜類成分(13、14、15、16、17)低。其中打分值最低的短鏈脂肪烴(醇)：1、2、4、5，其碳鏈長度為7～14。而碳鏈稍長的6 和7的結合力稍強一些。與鏈狀脂肪烴(醇)比較，環(huán)狀脂肪烴(醇)，如8、9、10、11、12的結合力要明顯提高，特別是化合物12，與TLR2(PDB ID：5D3I)結合常數(shù)為-8.3 kcal/mol，甚至超過了TLR2與原配體PCW的結合常數(shù)(-7.4 kcal/mol)。進一步比較發(fā)現(xiàn)，碳原子數(shù)為10～12的化合物8、9、10的結合力弱于碳原子數(shù)為14的化合物11和12。倍半萜化合物16和17對18種蛋白(基因)普遍具有較強的結合力，特別是對TLR2、κ阿片受體(PDB ID：4DJH)、5HT2AR(PDB ID：6A93)等蛋白，結合常數(shù)-8.0 kcal/mol左右。但單萜類化合物13、14、15的結合常數(shù)普遍較低，這與已有的4-萜烯醇(13)、松油醇(14)以及α-蒎烯(15)的良好抗炎活性的報道不盡一致[15]。在利用軟件進行分子對接過程中，配體化合物除了應具有相關的官能團外還應具備一定的空間體積，以便于與所處位置的氨基酸殘基有較強的結合，但單萜類化合物(13、14、15)的結構簡單，分子較小，在計算機對接模型中未能體現(xiàn)出較好的結合力?？傮w而言，表2中分值較高的化合物為環(huán)十四烷(11)、2-羥基環(huán)十五烷酮(12)、β-石竹烯(16)和蛇麻烯(17)。

從受體的角度分析，信號傳導與活化轉錄因子 3(STAT3，PDB ID：1BG1)和白介素-1β 轉化酶(Caspase-1，PDB ID：1RWN)與上述化合物的結合力普遍較低，結合能在-3.2～-5.5 kcal/mol之間。而5D3I、4DJH、5C1M、6A93、2GMX等蛋白表現(xiàn)出較強的結合力，結合能在-7.5～-8.3 kcal/mol之間。選取這5個蛋白與化合物11、12、16和17進一步進行折線圖分析(見圖2)?？梢钥闯觯衔?1、16、17對4DJH的結合能力較強，而化合物12對5D3I的結合力最強，為-8.3 kcal/mol。

表2 化合物(1～17)與受體對接打分值(kcal/mol)

圖2 化合物11、12、16和17與5種蛋白結合能折線圖

3.2 化合物與蛋白對接的示意圖

化合物11、16、17與4DJH，12與5D3I對接的三維示意圖見圖3。圖中可見化合物均能較好地卡在空腔中，契合度較高。

在平面圖(見圖4)中可以發(fā)現(xiàn)，化合物11的脂肪環(huán)與4DJH中的GLN115、ILE316、TYR320、TYR66、VAL69、THR321、VAL65、ILE62、TYR313等多個氨基酸殘基之間存在范德華力；同時脂肪環(huán)還有ALA317氨基酸殘基形成Alkyl鍵(圖4A)。化合物12的脂肪環(huán)與5D3I 中VAL302、ASN267、PHE266、ASP263、PHE325、ASP327、GLY293、ASP294、ASN296、PRO297、THR330等多個氨基酸殘基之間存在范德華力；羰基與PHE295形成氫鍵(圖4B)。化合物16與4DJH中的PHE314、SER116、GLN115、TYR66之間存在范德華力；其甲基以及碳環(huán)分別與ILE62、TYR119、ALA317形成Alkyl鍵；碳環(huán)雙鍵與TYR119、TYR313氨基酸殘基形成Pi-Alkyl鍵(圖4C)?；衔?7與4DJH中的PHE314、ILE316、TYR320、SER116、GLN115等氨基酸殘基之間存在范德華力；其甲基分別與TYR119、ILE62、ALA317、TYR66等氨基酸殘基形成Alkyl鍵；碳環(huán)雙鍵與ALA317和TYR313氨基酸殘基形成Pi-Alkyl鍵；10位CH2與TYR119氨基酸殘基形成Pi-Sigma鍵(圖4D)。

注：A：11/4DJH；B：12/5D3I；C：16/4DJH；D：17/4DJH。圖3 化合物與蛋白分子對接的三維圖

注：A：11/4DJH；B：12/5D3I；C：16/4DJH；D：17/4DJH。圖4 化合物與蛋白分子對接的平面圖

4 討論

白芷是我國四十種大宗常用中藥材品種之一，在中醫(yī)臨床上常用來治療各類疼痛，如頭痛、面部疼痛和瘡瘍腫痛方面。多種模型中白芷揮發(fā)油均表現(xiàn)優(yōu)良的抗炎鎮(zhèn)痛活性，并且與白芷香豆素聯(lián)用時有明顯的協(xié)同作用[5-6]。但不同品種之間、同一品種的不同產地之間、同一產地的不同地塊之間的白芷揮發(fā)油之間都有明顯的差異[16]，且多數(shù)研究未能將化學組分分析與藥理活性測試結合起來。而揮發(fā)油的化學組分與所用藥材和提取工藝有較大，為了保證揮發(fā)油化學組分與藥理活性的對應關系，本文對接采用了由同一課題組完成的化學組分數(shù)據[17]和藥理活性指標[3-4]。白芷揮發(fā)油占藥材的質量比重較低，因此選取了揮發(fā)油中占比0.5%(約占生藥材中二十萬分之一)[17]以上的成分進行分子對接。

化合物36和41是多種香料的重要成分，在白芷中的含量為0.69%個0.54%，含量雖少，但已有的研究表明，二者具有良好的抗炎等藥理活性。其他報道化合物單萜或倍半萜，但含量更低，本文中未進行探討?；衔?5(揮發(fā)油中質量百分比1.57%)是化合物45(揮發(fā)油中質量百分比4.17%)的衍生物，目前尚未有廣泛的藥理活性報道。但化合物75結構類似物麝香酮具有顯著的抗炎等藥理活性[18]，提示我們化合物75值得進一步研究其抗炎等活性。白芷揮發(fā)油中的倍半萜以及大環(huán)類結構是后續(xù)研究中重點關注的化合物。

阿片受體(κOR和μOR)是重要的中樞鎮(zhèn)痛作用靶點，但尚未發(fā)現(xiàn)白芷成分基于κOR或μOR的鎮(zhèn)痛研究。本次的分子對接顯示，κOR可能與白芷揮發(fā)油中的倍半萜等成分具有良好的結合能力，是白芷鎮(zhèn)痛的潛在關鍵結合蛋白。TLR2和JNK-1是抗炎鎮(zhèn)痛的作用靶點，本處的分子模擬對接顯示化合物36、41、45和75均與TLR2及JNK-1具有良好的結合能力，可能是白芷揮發(fā)油抗炎和鎮(zhèn)痛的關鍵蛋白之一。后續(xù)的細胞等藥理實驗中將重點關注這些蛋白。

本文以化合物-靶點相互作用為切入點，揭示了白芷揮發(fā)油與抗炎鎮(zhèn)痛的特點。即預測了白芷揮發(fā)油治療疼痛的活性成分，又明確了其作用靶點,后續(xù)的研究中將采用細胞或動物模型驗證上述發(fā)現(xiàn)，以期為白芷的研究和開發(fā)提供一定的科學依據。