黃詠明，宋 放，王 策，姚京磊，王志靜，何利剛，吳黎明，蔣迎春

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹(shù)茶葉研究所，湖北 武漢 430064)

根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，其功能與根系形態(tài)和生理特性相關(guān)[1]。適當(dāng)抑制根系頂端優(yōu)勢(shì)，能改善根系形態(tài)結(jié)構(gòu)和分布，提高根系整體活力和苗木成活率[2]。側(cè)根相比主根更能充分地與土壤中的水分和礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)接觸[3]，也更容易感知外界環(huán)境的刺激[4]。因此，側(cè)根的多少與根系的整體活力及水分和養(yǎng)分的利用率密切相關(guān)[5]。主根修剪是苗木培育過(guò)程中常用的根系干擾技術(shù)[6]，通常以切斷主根來(lái)促進(jìn)側(cè)根的發(fā)生。例如，在葡萄[7]、桃[8]試管苗移栽時(shí)進(jìn)行根系修剪可促進(jìn)新根系的形成和生長(zhǎng)。

植物根系生長(zhǎng)發(fā)育離不開(kāi)細(xì)胞的分裂與分化，而植物激素可能是整合細(xì)胞周期與根系發(fā)育的關(guān)鍵因子[9]，其含量變化受遺傳特征、栽培措施等的影響[10]。根系修剪促進(jìn)側(cè)根生長(zhǎng)可能與根部IAA含量增加有關(guān)[11]。側(cè)根的發(fā)育是植物激素信號(hào)途徑相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、受體蛋白及上下游基因共同作用的結(jié)果。Meng等[12]指出，IAA11、IAA13、HEMEOXYGENASE1(HOX1)、CYCLOPHILIN2(CYP2)等基因是IAA信號(hào)途徑中調(diào)控水稻側(cè)根發(fā)育的關(guān)鍵基因。Zhu等[13]從水稻根系中克隆了一個(gè)控制側(cè)根發(fā)育最關(guān)鍵的Aux/IAA基因OsIAA11。隨后，Kitomi等[14]克隆了側(cè)根發(fā)育控制基因OsIAA13，而OsIAA13對(duì)側(cè)根的調(diào)控可能與OsIAA11類似，可通過(guò)調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)影響側(cè)根的發(fā)育。Kang等[15]發(fā)現(xiàn)，OsCYP2功能缺失突變體Oscyp2的側(cè)根發(fā)育存在缺陷。另外，Guo等[16]和Han等[17]分別在番茄和玉米中發(fā)現(xiàn)HOX1基因參與調(diào)控側(cè)根的形成。目前，有關(guān)植物內(nèi)源激素與根系形成的關(guān)系已開(kāi)展了大量研究，也逐漸明確了各種激素調(diào)控根系發(fā)育的作用關(guān)系[18-21]。近年來(lái)，研究者廣泛開(kāi)展了根系修剪或斷根對(duì)植物根系形態(tài)構(gòu)建、生理生化響應(yīng)的研究[22-23]，但在分子水平上研究根系修剪與植物側(cè)根形成的關(guān)系還鮮見(jiàn)報(bào)道。

柑橘是一種典型的根毛較少且營(yíng)養(yǎng)吸收效率較低的果樹(shù)，需要健壯發(fā)達(dá)的根系提高對(duì)水分和養(yǎng)分的接觸面積和吸收效率。因此，可利用根系修剪作為調(diào)控柑橘根系形態(tài)構(gòu)建的一項(xiàng)農(nóng)業(yè)技術(shù)措施，但相關(guān)的作用機(jī)制還不清楚。鑒于此，本研究以柑橘栽培常用砧木——枳[Poncirustrifoliata(L.)Raf.]為試材，研究根系修剪對(duì)枳實(shí)生苗生長(zhǎng)發(fā)育、根系構(gòu)型以及營(yíng)養(yǎng)吸收的影響，并通過(guò)分析調(diào)控側(cè)根發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，初步探討根系修剪影響柑橘根系發(fā)育的分子作用機(jī)制，以期為柑橘優(yōu)質(zhì)壯苗的培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枳果實(shí)采自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)茶葉研究所國(guó)家柑橘原種保存及良種繁育基地。2018年3月19日和2019年3月21日分別從果實(shí)中取出種子，用1.0 mol·L-1NaOH溶液搓洗種子去除果膠，蒸餾水清洗3次后，用75%乙醇在超凈臺(tái)中進(jìn)行消毒30 s，隨后用2%的次氯酸鈉消毒15 min，最后用無(wú)菌水清洗3次。將清洗好的種子撒播于事先經(jīng)過(guò)高壓蒸汽(0.11 MP，121 ℃，1 h，下同)滅菌處理的河沙中，并置于晝/夜溫度為25℃/22℃、相對(duì)濕度為80%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽。催芽試驗(yàn)地點(diǎn)為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)茶葉研究所南湖大樓生理實(shí)驗(yàn)室。

2.2 試驗(yàn)處理

待枳實(shí)生苗長(zhǎng)至4～6片真葉時(shí)進(jìn)行移栽，選取莖粗、株高、葉片數(shù)一致的48株枳實(shí)生苗，分成4組，每組12株，移苗前分別進(jìn)行4種不同水平的根系修剪處理，處理一為全根處理(即不進(jìn)行根系修剪處理，RP0)，處理二為輕度根系修剪處理(即切除1/3的主根，RP1)，處理三為中度根系修剪處理(即切除1/2的主根，RP2)，處理四為重度根系修剪處理(即切除2/3的主根，RP3)。根系修剪處理后的實(shí)生苗種植于經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌的基質(zhì)中，每4株1盆，每個(gè)處理共計(jì)3盆。試驗(yàn)用盆規(guī)格：上口徑16 cm，下口徑11 cm，高14 cm。每盆裝入基質(zhì)3.0 kg，基質(zhì)由土、河沙按2∶1(體積比)混合而成。試驗(yàn)材料置于溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為60%～70%的溫室中培養(yǎng)，試驗(yàn)期間每周每盆澆300 mL的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液2次。2018年和2019年的試驗(yàn)處理一致。

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定

待植株生長(zhǎng)3個(gè)月后，將植株從基質(zhì)中取出，用清水輕輕清洗根和葉片后，用吸水紙擦干，立即檢測(cè)植株生長(zhǎng)指標(biāo)(株高、莖粗、鮮重)，每個(gè)處理中一半的根系盡快用錫箔紙包好并液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱內(nèi)，用于提取RNA；另一半放入80 ℃烘箱殺青2 h后，再轉(zhuǎn)入55 ℃烘箱烘干72 h后用于植株?duì)I養(yǎng)元素的檢測(cè)。

采用EPSON V7700彩色根系掃描儀掃描根系，并用WinRHizo根系分析軟件分析根系掃描圖片，獲取枳實(shí)生苗的根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)、根表面積等根系構(gòu)型數(shù)據(jù)。

利用H2SO4-H2O2法消煮，使用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定植株根系N元素的含量，并使用電感耦合等離子光譜儀(ICP)測(cè)定根系P、K、Ca、Mg、B、Fe、Na、Zn等元素的含量。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)

取保存于-80℃的枳實(shí)生苗根系樣品，使用液氮磨樣并分裝，隨后按照說(shuō)明書(shū)的方法使用Trizol(Life，美國(guó))提取總RNA。使用NanoDrop2000檢測(cè)RNA的濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。隨后用5X All-in-one Master Mix with AccuRT Genomic DNA Removal Kit(ABM，加拿大)試劑盒進(jìn)行去除RNA中的基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

通過(guò)Blast方法在甜橙基因組(http://citrus.hzau.edu.cn/cgi-bin/orange/blast)中檢索水稻中已報(bào)道的根系發(fā)育相關(guān)基因在柑橘中的同源基因[12]，并使用NCBI的Primer-Blast程序設(shè)計(jì)定量PCR引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

使用Applied Biosystems PCR-7500儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，具體步驟參照EvaGreen 2X qPCR Maste Mix-Low ROX(ABM，加拿大)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL：Acer qpcr SYBR Green mix 5 μL、正反向引物各0.5 μL、cDNA模板0.5 μL、ddH2O 3.5 μL。每個(gè)處理做3個(gè)生物重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，使用Elongation factor 1 α基因作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)的處理采用相對(duì)定量法，參照2-ΔΔCt法進(jìn)行分析[24-26]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS(8.1)軟件的ANOVA過(guò)程進(jìn)行處理間的差異顯著性檢驗(yàn)，并使用LSD法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系修剪對(duì)枳植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2018年試驗(yàn)結(jié)果表明，與RP0相比，RP1對(duì)枳實(shí)生苗株高、莖粗和鮮重沒(méi)有顯著影響(P<0.05)；RP2增加了枳實(shí)生苗株高和莖粗，顯著增加了地上部和根系鮮重(P<0.05)；RP3降低了枳實(shí)生苗株高和地上部鮮重，顯著降低了根系鮮重(P<0.05)。2019年試驗(yàn)結(jié)果表明，與RP0相比，RP1顯著增加了枳實(shí)生苗株高(P<0.05)，但顯著降低了植株莖粗(P<0.05)，而對(duì)植株鮮重沒(méi)有顯著影響；RP2顯著增加了株高和莖粗，以及地上部和根系鮮重(P<0.05)；RP3顯著降低了根系鮮重(P<0.05)，但對(duì)株高、莖粗、地上部鮮重沒(méi)有顯著影響(表2)。由此可見(jiàn)，適度根系修剪(RP2)能夠促進(jìn)植株生長(zhǎng)，增加生物量，輕度或重度根系修剪處理對(duì)植株生長(zhǎng)無(wú)效應(yīng)或負(fù)效應(yīng)。

表2 不同根系修剪處理下枳實(shí)生苗生長(zhǎng)情況Table 2 The growth of Poncirus trifoliata seedlings under different root pruning treatments

2.2 根系修剪對(duì)枳根系構(gòu)型的影響

根系修剪處理促進(jìn)了枳實(shí)生苗側(cè)根的發(fā)生，改變了根系構(gòu)型，且RP2植株根系構(gòu)型最優(yōu)(圖1)。2018年和2019年的試驗(yàn)均表明，與RP0相比，RP1和RP3增加了枳實(shí)生苗側(cè)根數(shù)量，但對(duì)根系的總長(zhǎng)度、表面積和平均長(zhǎng)度沒(méi)有顯著影響；RP2顯著(P<0.05)增加了側(cè)根數(shù)、根系總長(zhǎng)度和根系表面積(表3)。由此可見(jiàn)，不同程度的根系修剪均能促進(jìn)側(cè)根的生長(zhǎng)，其中RP2對(duì)枳實(shí)生苗根系構(gòu)型參數(shù)促進(jìn)效果最優(yōu)。

表3 不同根系修剪處理下枳實(shí)生苗根系構(gòu)型參數(shù)Table 3 The root architecture system parameters of Poncirus trifoliata seedlings under different root pruning treatments

2.3 根系修剪對(duì)枳實(shí)生苗根系營(yíng)養(yǎng)元素含量的影響

2018年和2019年的試驗(yàn)結(jié)果表明，不同水平根系修剪處理對(duì)枳實(shí)生苗根系大量元素、中量元素和微量元素含量影響不同(表4)。整體來(lái)看，與RP0相比，RP1、RP2和RP3均增加了枳實(shí)生苗根系大量元素和微量元素含量，但差異顯著水平各異。RP1僅顯著增加了植株根系Ca元素含量，RP2顯著增加了植株P(guān)、K、Ca、B、Fe、Na和Zn元素的含量，RP3顯著提高了植株N、K、Mg和Zn元素的含量(P<0.05)。這說(shuō)明一定程度的根系修剪處理有利于枳實(shí)生苗對(duì)部分營(yíng)養(yǎng)元素的吸收和積累，其中RP2效果最好。

表4 不同根系修剪處理下枳實(shí)生苗根系營(yíng)養(yǎng)元素含量Table 4 The contents of nutrient elements in roots of Poncirus trifoliata seedlings under different root pruning treatments

2.4 根系修剪對(duì)枳側(cè)根發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了初步探討根系修剪處理調(diào)控側(cè)根發(fā)育的分子機(jī)理，本研究選取了4個(gè)已經(jīng)報(bào)道的側(cè)根生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵基因(HOX1、CYP2、IAA11、IAA13)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)(圖2)。與RP0相比，HOX1基因在根系修剪處理后的表達(dá)量均升高，但僅RP2植株根系HOX1的表達(dá)量顯著增加；RP1對(duì)CYP2基因表達(dá)量無(wú)顯著影響，RP2和RP3均顯著增加了植株根系CYP2基因的表達(dá)量，且兩者間差異顯著；RP1和RP2均顯著降低了植株根系IAA11基因表達(dá)量，但RP3未達(dá)到顯著水平；RP1、RP2和RP3均顯著降低了IAA13基因表達(dá)量，說(shuō)明不同根系修剪處理誘導(dǎo)側(cè)根發(fā)育關(guān)鍵基因不同的表達(dá)模式。

3 討論

前人研究表明，斷根處理能夠誘導(dǎo)植物側(cè)根的發(fā)生，促使根系更加發(fā)達(dá)[27]。本研究中，從4種根系修剪水平處理后的根系形態(tài)來(lái)看，中度根系修剪(RP2)的枳實(shí)生苗側(cè)根最多且根系構(gòu)型形態(tài)最好。這與許建蘭等[8]在桃根尖基部切去根長(zhǎng)1/2的研究結(jié)果一致。但與Zhang等[28]在核桃上的研究結(jié)果不盡相同，重度根系修剪(切除2/3主根)比中度根系修剪(切除1/3主根)對(duì)根系分支和表面積增加效果更顯著。這可能與樹(shù)種類型有關(guān)，基因型不同響應(yīng)根系修剪程度的策略可能不同。此外，根系修剪誘導(dǎo)了枳實(shí)生苗主根剪口處多條側(cè)根的形成(圖1)。主根修剪會(huì)誘導(dǎo)苗木形成多主根型(multiple-taprooted)根系，從而減輕主根的變形螺旋，并優(yōu)化根系的對(duì)稱性，進(jìn)而潛在地降低苗木發(fā)生倒伏的風(fēng)險(xiǎn)[29]。因此，適宜強(qiáng)度的根系修剪可優(yōu)化根系在土壤中的形態(tài)分布，促進(jìn)植株根系在土壤中穩(wěn)扎。

根系修剪可促進(jìn)地上部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向地下運(yùn)輸，以幫助根系形態(tài)的重新建成。Budiarto等[30]指出，柑橘根系被修剪50%后，糖分會(huì)立即轉(zhuǎn)移到根系為新根生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備。本研究中，重度根系修剪(RP3)顯著降低了枳實(shí)生苗根系鮮重，但中度根系修剪(RP2)顯著增加了枳實(shí)生苗株高、莖粗和鮮重，促進(jìn)了植株生長(zhǎng)。這說(shuō)明，根系修剪程度過(guò)重會(huì)消耗更多的能量來(lái)恢復(fù)根系功能，從而間接地抑制了地上部的生長(zhǎng)發(fā)育。RP2促進(jìn)枳實(shí)生苗生長(zhǎng)可能與優(yōu)化的根系構(gòu)型提高了養(yǎng)分吸收效率有關(guān)。因?yàn)?，根系?gòu)型的改善能夠增加水分和養(yǎng)分的利用率，從而增加植物的生物量[31]。Bréda等[32]指出，根系修剪通過(guò)誘發(fā)植株形成密集而龐大的根系使植株獲得充足的水分和養(yǎng)分是一種補(bǔ)充機(jī)制。這也解釋了本研究中根系修剪處理植株要比對(duì)照植株?duì)I養(yǎng)元素含量高些，特別是RP2植株具有較高的B、Fe、Na、Zn等營(yíng)養(yǎng)元素含量。

本研究中，根系修剪促進(jìn)了枳實(shí)生苗根系HOX1和CYP2基因的表達(dá)，但抑制了IAA11和IAA13基因的表達(dá)，且基因表達(dá)差異性依賴于根系修剪水平。有研究指出，HOX1參與了生長(zhǎng)素(IAA或IBA)和茉莉酸甲酯(MJ)誘導(dǎo)不定根或側(cè)根的形成[33-35]。IAA家族基因IAA11和IAA13是側(cè)根發(fā)育重要的負(fù)調(diào)控基因[13-14]，而CYP2基因突變體可通過(guò)誘導(dǎo)IAA11的積累，從而抑制生長(zhǎng)素信號(hào)調(diào)控側(cè)根的發(fā)育[36]，暗示根系修剪可能通過(guò)誘導(dǎo)HOX1和CYP2基因的表達(dá)，并抑制IAA11和IAA13基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)柑橘植株側(cè)根的發(fā)生及生長(zhǎng)。這也表明，環(huán)境因子可通過(guò)誘導(dǎo)側(cè)根發(fā)育相關(guān)基因不同的表達(dá)模式，從而調(diào)控側(cè)根的發(fā)育。

綜上所述，中度根系修剪(RP2)優(yōu)化了枳實(shí)生苗根系構(gòu)型，改善了植株?duì)I養(yǎng)水平，促進(jìn)了植株生長(zhǎng)，在柑橘幼苗移栽過(guò)程中可以進(jìn)行適度的根系修剪處理來(lái)誘發(fā)側(cè)根，提高苗木質(zhì)量。同時(shí)本研究初步揭示了不同根系修剪水平條件下HOX1、CYP2、IAA11、IAA13等側(cè)根發(fā)育關(guān)鍵基因表達(dá)量的變化規(guī)律，為深入挖掘根系修剪調(diào)控柑橘植株生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制打下了基礎(chǔ)。