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        不同劑量射線對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者mTOR信號(hào)通路的影響

        2021-03-03 14:31:42肖旭陽(yáng)杜天宇周玄王立坤
        關(guān)鍵詞:肌醇雷帕磷酸化

        肖旭陽(yáng),杜天宇,周玄,王立坤

        (錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧 錦州 121000)

        肺癌是臨床上常見(jiàn)的一種原發(fā)性惡性腫瘤,起源于氣管、支氣管粘膜或腺體,根據(jù)組織病理學(xué)特點(diǎn)不同,可分為非小細(xì)胞肺癌與小細(xì)胞癌,其中非小細(xì)胞肺癌最為常見(jiàn),占總發(fā)病率的85%以上,不具有傳染性,但遺傳性、家族聚集性較強(qiáng),處于臨床I期的患者其5年生存率僅有60%~70%,發(fā)病率、死亡率較高,在女性人群中,死亡率位列第二,是全球癌癥死亡的主要原因之一,早期癥狀不明顯,進(jìn)一步的會(huì)發(fā)生惡化與轉(zhuǎn)移,等確診時(shí),大多數(shù)患者已處于疾病晚期,治療難度較大,給患者的生命健康造成了極大的威脅[1-2]。臨床上常用手術(shù)的方法治療非小細(xì)胞肺癌,可一定程度控制病情發(fā)展,但由于疾病晚期患者,免疫力降低,身體自我保護(hù)機(jī)制搜到損害,削弱了手術(shù)整體效果,而放射治療聯(lián)合化學(xué)治療成為了治療非小細(xì)胞肺癌的有效方法[3-4]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在肺癌細(xì)胞的增殖、疾病的發(fā)展中起著重要作用,激活mTOR信號(hào)通路,可加快細(xì)胞的新陳代謝,與癌癥進(jìn)展有著密切關(guān)系[5-6]?,F(xiàn)階段單一利用雷帕霉素激活mTOR信號(hào)通路方法并不成熟,正處于研究階段,雷帕霉素類藥物有希望成為治療非小細(xì)胞肺癌的首選藥物。本研究探討不同劑量射線作用對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者mTOR信號(hào)通路的影響,具體報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 試劑和材料

        所用培養(yǎng)液為:RPMI1640,試劑有:谷氨酰胺、氨芐青霉素鈉、硫酸鏈霉素、雷帕霉素,胎牛血清,mTOR、p70S6K、p-4EBPI、β-actin,免疫組織化學(xué)SP試劑盒、二氧基聯(lián)苯胺(DBA)顯色劑,24孔板、96孔板、細(xì)菌培養(yǎng)皿,F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞檢測(cè)儀、Annexin V-FITC凋亡試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒,X射線感光膠片、定影液、顯影液。其中,ELC發(fā)光試劑盒購(gòu)自Millipore,X射線感光膠片、定影液和顯影液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

        1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

        人非小細(xì)胞肺癌系A(chǔ)549購(gòu)自ATCC(VA,USA),使用含10%胎牛清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液,在無(wú)菌條件下進(jìn)行培養(yǎng),溫度設(shè)置為37 ℃,細(xì)胞融合度為80%時(shí),將經(jīng)胰蛋白酶消化過(guò)的細(xì)胞收集起來(lái)[7-8]。

        1.3 電離輻射

        進(jìn)行細(xì)胞種植,融合度≥60時(shí),清洗培養(yǎng)液,利用Varian-23Ex-1、X-Ray generator進(jìn)行細(xì)胞照射,照射方式為:直線加速器照射(M9-XHA600C),照射野是10 cm×10 cm,X射線能量:6 MV,劑量分別為2、4、6、8 Gy。

        1.4 Wastern Blot檢測(cè)

        提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)移后,加入100 mL/L脫脂奶粉,密封1 h,加入1∶200稀釋過(guò)的一抗,溫度保持恒溫4 ℃下過(guò)夜,加入1∶5000稀釋過(guò)的HRP-IgG,室溫孵育60 min,通過(guò)化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影,掃描膠片[9-10]。

        1.5 細(xì)胞活力檢測(cè)(MTT)

        進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)(MTT),在96孔板中接種細(xì)胞,時(shí)間為1 w,1 w后才有0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液進(jìn)行染色,溶解,使用分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度檢測(cè),利用電腦繪制圖譜[11-12]。

        1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

        將細(xì)胞接種于6孔板中,進(jìn)行貼壁處理,加入不同濃度的matrine,在不同的時(shí)間短觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,觀察時(shí)間段為24、48、72 h,然后制作細(xì)胞懸液,檢測(cè)細(xì)胞活性,重復(fù)進(jìn)行3次,減少誤差。

        1.7 克隆形成試驗(yàn)

        將1×103的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞接種到含有雷帕霉素的培養(yǎng)基中,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),規(guī)定不同劑量射線照射的時(shí)間、天數(shù),用甲醇固定細(xì)胞,使用吉姆薩染色,統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)量,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次。

        1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        2 結(jié) 果

        2.1 雷帕霉素藥物對(duì)mTOR信號(hào)通路及下游信號(hào)分子的抑制作用

        隨著雷帕霉素藥物濃度升高,mTOR、p70S6K、p-4EBPI及AKT表達(dá)降低,β-actin作為內(nèi)參,見(jiàn)圖1。

        圖1 雷帕霉素藥物對(duì)mTOR信號(hào)通路及下游信號(hào)分子的抑制作用

        2.2 雷帕霉素對(duì)非小細(xì)胞肺癌放療敏感性的影響

        觀察組細(xì)胞存活能力低于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)圖2。

        系列1代表A549,系列2代表A549+雷帕霉素,系列3代表(A549+雷帕霉素)+4 Gy,系列4代表(A549+雷帕霉素)+8 Gy

        2.3 雷帕霉素作用下非小細(xì)胞肺癌放療對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用

        將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549接種于培養(yǎng)皿中(直徑:100 mm),觀察組用含50 nmol/L的雷帕霉素培養(yǎng)基,對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞分別用劑量為4 Gy、8 Gy的射線照射2 w后,甲醇固定,吉姆薩染色照相,發(fā)現(xiàn)4 Gy觀察組細(xì)胞平均克隆數(shù)目為(56±4),8 Gy觀察組細(xì)胞平均克隆數(shù)目為(18±3),低于對(duì)照組(146±23)(P<0.05)。

        3 討 論

        非小細(xì)胞肺癌作為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,多發(fā)于老年人群,近年來(lái)隨著生活方式的改變,發(fā)病人群逐漸年輕化,根據(jù)病理類型可分為腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌、腺鱗癌、唾液腺型腫瘤等,發(fā)病率、死亡率越來(lái)越高,細(xì)胞分化發(fā)生異常、增殖不受控制,是肺癌細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的最顯著的兩個(gè)特征,目前常用放療或化療的方法進(jìn)行治療[13-14]。近年來(lái),mTOR通路在肺癌治療中受到了廣泛關(guān)注,當(dāng)PI3K收到受體酪氨酸激酶、Ras、整合素以及各種生長(zhǎng)因子等多種因子,被激活時(shí),可加快磷酸化肌醇誘導(dǎo)3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇及3,4-二磷酸磷脂酰肌醇的生成,被激活的Akt,通過(guò)3-磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1及3-磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶2磷酸化,將信號(hào)傳遞給mTOR,進(jìn)而兩種復(fù)合形態(tài)的mTOR,對(duì)下游的mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),影響細(xì)胞的新陳代謝速度。另外在腫瘤細(xì)胞中,AKT可通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶磷酸化激活caspase9、Bad、FOXO、GSK-3b及IKK等因子促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡。同時(shí),pAKT還可以緩解TSC1/2和Rheb對(duì)mTOR的抑制,而激活的mTOR與RAPTOR結(jié)合后可以通過(guò)mTORC1磷酸化激活核糖體S6激酶,干預(yù)5’-TOP結(jié)構(gòu)對(duì)mRNA的翻譯,影響細(xì)胞生長(zhǎng)。有研究表明,mTOR信號(hào)通路與肺癌細(xì)胞的增殖關(guān)系密切,可從多種方面加快細(xì)胞癌變,激活mTOR信號(hào)通路,會(huì)加快細(xì)胞的凋亡,且機(jī)體內(nèi)mTOR蛋白水平與肺癌化療效果呈正相關(guān),抑制該通道,逆轉(zhuǎn)耐藥性,提高化療、放療的效果[15-16]。但目前關(guān)于mTOR信號(hào)通路對(duì)非小細(xì)胞肺癌放療的敏感性報(bào)道較少,本研究在此基礎(chǔ)上展開了研究。

        本研究中,觀察組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞存活能力低于對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明mTOR信號(hào)通路對(duì)非小細(xì)胞肺癌放療效果較好。mTOR信號(hào)通路被激活后,可將磷酸化下游靶蛋白p70S6k和p-4EBPI轉(zhuǎn)移,加快細(xì)胞增殖,而通過(guò)雷帕霉素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制作用,降低mTOR蛋白、p70S6k和p-4EBPI的表達(dá)能力,構(gòu)建mTOR信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞[17-18]。細(xì)胞凋亡是基因程序化、生命力頑強(qiáng)的細(xì)胞自殺的一個(gè)過(guò)程,可調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞平衡,清除多余的細(xì)胞,促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝,而細(xì)胞在死亡過(guò)程中發(fā)生異常,會(huì)減少細(xì)胞的增殖,加快細(xì)胞死亡速度,成了治療非小細(xì)胞肺癌的重要方法之一。自噬可加快細(xì)胞死亡速度,不同劑量射線作用可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡,mTOR通路誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬和凋亡,抑制細(xì)胞增殖,從而起到抑制腫瘤的作用。而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可選擇性與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上高親和力的受體硌氨酸激酶結(jié)合,造成受體磷酸化,從而發(fā)生活化,加快內(nèi)皮細(xì)胞遷移,mTOR基因表達(dá)水平作為Akt的下游信號(hào),受血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子影響,可提高診斷靈敏度[19-20]。另外mTOR由mTORC1和mTORC2兩種多蛋白復(fù)合體組成,mTORC1對(duì)雷帕霉素敏感度較高,mTORC2對(duì)雷帕霉素耐受性較強(qiáng),mTORC1可調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞增殖,當(dāng)mTOR失調(diào)后,將導(dǎo)致癌癥等諸多疾病發(fā)生,而活化后的mTORC1可誘導(dǎo)核糖體S6激酶、真核翻譯啟動(dòng)因子4E,mTORC2參與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié),控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝[21]。另外肺癌細(xì)胞在增殖狀態(tài),會(huì)產(chǎn)生一些放射耐受細(xì)胞,可通過(guò)多種細(xì)胞因子、激素及生長(zhǎng)因子進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),改變信號(hào)通路,使機(jī)體對(duì)放療產(chǎn)生抗拒,而哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白是AKT信號(hào)通路下游的效應(yīng)分子,可促進(jìn)細(xì)胞周期素的表達(dá),發(fā)揮AKT的抑制作用,提高對(duì)射線的敏感性,從而提高放療敏感性。

        綜上所述,mTOR信號(hào)通路被抑制后,可促進(jìn)細(xì)胞凋亡速度,加快細(xì)胞新陳代謝能力,提高放療效果,增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌放療敏感性。

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