宋 寒， 趙振芳， 朱盈蕊， 謝亞雄， 朱 雁， 任明浩

（1.河南省科學(xué)院高新技術(shù)研究中心，鄭州 450003； 2.鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州 450000；3.華北水利水電大學(xué)地球科學(xué)與工程學(xué)院，鄭州 450046）

甲氧普烯，又名烯蟲酯，化學(xué)名為7，11-三甲基-2，4-十二碳二烯酸異丙酯，是一種昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類生物化學(xué)殺蟲劑［1］，通過抑制未成齡的幼蟲變態(tài)，干擾昆蟲的脫皮過程，使成蟲失去繁殖能力，從而有效地控制害蟲種群增長(zhǎng)［2-3］. 甲氧普烯與天然昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑結(jié)構(gòu)類似，且調(diào)節(jié)劑功能一致，可用于多種害蟲防治，對(duì)非靶生物沒有危害［4-5］. 甲氧普烯在土壤中會(huì)較快地分解成為二氧化碳和水，屬于環(huán)保友好型殺蟲劑. 目前甲氧普烯在美國(guó)、歐洲、日本、新西蘭等經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)田治蟲、食品防蟲、蚊控、寵物保健等領(lǐng)域［6-7］. 2018年甲氧普烯成為在我國(guó)登記的第一個(gè)生物源農(nóng)藥［8］. 隨著甲氧普烯的廣泛使用其將在農(nóng)業(yè)綠色管控中發(fā)揮重要作用，推進(jìn)國(guó)家質(zhì)量興農(nóng)發(fā)展［9-10］.

根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局《化學(xué)藥物殘留溶劑研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》在原料藥生產(chǎn)制備過程中使用的各類有機(jī)溶劑以及在生產(chǎn)過程中可能生成的新的有機(jī)溶劑，且沒有任何療效，且多數(shù)對(duì)人體和環(huán)境有一定的危害，為保障藥物的質(zhì)量和用藥安全性，需對(duì)殘留溶劑進(jìn)行研究和控制［11］.

頂空氣相色譜法將頂部空間萃取法和氣相色譜聯(lián)用的一種樣品分析方法. 頂部氣相色譜法是指將固體或液體樣品放入密閉的樣品容器中，在恒定的溫度下加熱震蕩，使樣品中的可揮發(fā)的氣體成分從密閉容器底部的固體或液體樣品中揮發(fā)至頂部空間，待揮發(fā)性氣體混合物在頂部空間達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，從頂部空間定量移取氣體部分并轉(zhuǎn)移到氣相色譜中進(jìn)行分析. 因此只有揮發(fā)性物質(zhì)達(dá)到氣相色譜儀，而非揮發(fā)性的物質(zhì)則留在樣品容器中［12］. 在面對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的樣品，尤其是較低揮發(fā)性基質(zhì)中的揮發(fā)性物質(zhì)的分析時(shí)，相對(duì)于液-液萃取、固相萃取等方法頂空萃取既可以避免樣品處理過程中的揮發(fā)性目標(biāo)物的損失同時(shí)又降低了非揮發(fā)共提取物的噪音干擾［13］，因此在分析此類樣品時(shí)，頂空萃取法成為一種理想的方法. 隨著頂空氣相色譜法的自動(dòng)化水平的提高，該方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于聚合物分析［14-15］、飲料和食品中揮發(fā)性成分［16-17］、血液中酒精［18-20］、水環(huán)境中揮發(fā)性有機(jī)物［21-23］以及香水和化妝品中香料等的分析［24］. 在制藥行業(yè)中，頂空氣相色譜法也廣泛用于確定活性藥物成分（API）和原料藥中的殘留溶劑［25］. 各國(guó)藥典也陸續(xù)將頂空氣相色譜法測(cè)定原料藥中的殘留溶劑收錄其中［26-27］.

甲氧普烯原料藥的生產(chǎn)過程中使用了多種有機(jī)溶劑，目前關(guān)于其溶劑殘留測(cè)定的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道.本研究建立的頂空氣相色譜法測(cè)定甲氧普烯原料藥中丙酮、異丙醇、四氫呋喃、環(huán)己烷等四種殘留溶劑的定量檢測(cè)方法. 該方法簡(jiǎn)單、快速、不污染設(shè)備，能滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需求.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試藥與試劑

甲氧普烯（洛陽(yáng)某制藥公司3批次），丙酮（色譜純，上海試劑一廠），異丙醇（色譜純，德國(guó)默克），四氫呋喃（色譜純，上海試劑一廠），環(huán)己烷（色譜純，上海試劑一廠），N，N-二甲基甲酰胺（頂空級(jí)，德國(guó)默克）.

1.2 儀器

Trace 1310（賽默飛世爾），TriplusRSH 頂空進(jìn)樣器（賽默飛世爾）.

PGH-300氫氣發(fā)生器（北京譜萊析科技公司），PGA-L空氣發(fā)生器（北京譜萊析科技公司）.

1.3 方法

1.3.1 限度確定 根據(jù)2015年版《中國(guó)獸藥典》一部附錄139頁(yè)獸藥中常見的殘留溶劑及限度規(guī)定：丙酮、異丙醇的限度為0.5%，四氫呋喃的限度為0.072%，環(huán)己烷的限度為0.388%.

1.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品0.1 g，置于20 mL 頂空瓶中，精密加入1 mL N，N-二甲基甲酰胺，密封，振搖使溶解.

1.3.3 對(duì)照品溶液的配置 分別精密稱取丙酮0.50 g，異丙醇0.50 g，四氫呋喃0.72 g、環(huán)己烷0.388 g，置于10 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺定容作為儲(chǔ)備液. 再分別精密量取0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL置于10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺定容至刻度，分別作為L(zhǎng)1、L2、L3、L4、L5 對(duì)照品溶液. 精密量取1 mL，置于20 mL頂空瓶中，頂空進(jìn)樣.

1.3.4 色譜條件 色譜柱：DB-624（30 m×0.53 mm×1.8 μm 6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷）；程序升溫40 ℃保持5 min，以10 ℃/min 升溫至160 ℃，維持1 min；檢測(cè)器：氫火焰離子檢測(cè)器（FID）；檢測(cè)器溫度：250 ℃；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；柱流速：1.5 mL/min；分流比：40∶1；頂空進(jìn)樣，孵化溫度為90 ℃，孵化時(shí)間20 min；進(jìn)樣體積：1.0 mL.

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 進(jìn)樣方式選擇 甲氧普烯具有較高的沸點(diǎn)，屬于非揮發(fā)性化合物，采用液體進(jìn)樣的方式分析，甲氧普烯在進(jìn)口不揮發(fā)會(huì)大量的留存在進(jìn)樣口導(dǎo)致進(jìn)樣口和色譜柱的污染. 而當(dāng)采用頂空氣相色譜法分析時(shí)，只有甲氧普烯中的揮發(fā)性的殘留溶劑進(jìn)入氣相色譜分析，甲氧普烯因其低揮發(fā)性會(huì)保留在樣品瓶中，從而避免污染儀器.

2.1.2 頂空條件優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)中考察50、60、70、80 ℃的孵化溫度對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響，當(dāng)孵化溫度達(dá)到70 ℃后再升高溫度，四種殘留溶劑的響應(yīng)值不再有明顯的提升（見圖1），因此選擇70 ℃作為實(shí)驗(yàn)的孵化溫度. 實(shí)驗(yàn)中考察10、15、20、30 min 的孵化時(shí)間對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響，當(dāng)孵化時(shí)間達(dá)到20 min 后頂空瓶中氣液兩相分配達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，再增加孵化時(shí)間四種殘留溶劑響應(yīng)增長(zhǎng)不明顯（見圖2）. 為節(jié)省分析時(shí)間更高效的分析樣品，選擇20 min 作為實(shí)驗(yàn)的孵化時(shí)間.

圖1 頂空孵化溫度對(duì)殘留溶劑檢測(cè)靈敏度對(duì)影響Fig.1 Effect of equilibration temperature on detection sensitivity of residual solvent

2.1.3 色譜柱選擇 在不同極性的色譜柱中篩查發(fā)現(xiàn)，由于丙酮和異丙醇沸點(diǎn)接近，在DB-5和RESTEK-WAX色譜柱中均不能實(shí)現(xiàn)基線分離；在DB-624色譜中丙酮、異丙醇、四氫呋喃、環(huán)己烷均能實(shí)現(xiàn)基線分離，且分析速度快、檢測(cè)靈敏度高，非常適合這四種殘留溶劑的定量分析要求，因此最終選擇DB-624色譜柱.

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1 方法專屬性 精密量取空白溶劑N，N-二甲基甲酰胺1 mL，置于20 mL頂空瓶中，頂空進(jìn)樣；另分別取供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)樣記錄色譜圖. 結(jié)果表明，空白溶劑不干擾目標(biāo)化合物，目標(biāo)化合物和相鄰峰之間分離度均大于1.5（見表1），符合藥典要求.

表1 四種殘留溶劑的保留時(shí)間、塔板數(shù)及分離度Tab.1 Retention time，theoretical plants and resolution of the four residual solvents

2.2.2 方法重復(fù)性 精密稱取同一批次樣品0.1 g，置于20 mL頂空瓶中，加入L3對(duì)照品溶液1 mL，震蕩使之溶解，頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖，外標(biāo)法定量，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，計(jì)算結(jié)果. 丙酮、異丙醇、四氫呋喃、環(huán)己烷含量的RSD均小于3.0%，分別為1.04%、1.07%、1.18%、1.03%.

2.2.3 方法檢測(cè)限和定量限 取對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，測(cè)定. 以信噪比約為3作為檢測(cè)限，結(jié)果丙酮、異丙醇、四氫呋喃、環(huán)己烷的檢測(cè)限分別為2.1、6.3、0.9、0.7 μg·mL-1；以信噪比約為10作為定量限，結(jié)果丙酮、異丙醇、四氫呋喃、環(huán)己烷的定量限分別為6.3、20.0、3.0、2.3 μg·mL-1.

2.2.4 方法線性關(guān)系 精密量取“1.3.3”中L1、L2、L3、L4、L5 對(duì)照品溶液，置于20 mL 頂空瓶中，頂空進(jìn)樣.以濃度為橫坐標(biāo)，響應(yīng)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，四種殘留溶劑線性方程結(jié)果見表2.

表2 四種溶劑的線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Tab.2 Linear equations，linear ranges and correlation coefficients（r）of four solvents

2.2.5 方法回收率 精密稱取已測(cè)定溶劑殘留含量的樣品9 份，分別精密加入L2、L3、L4 對(duì)照品溶液1 mL（各3份），按“1.3”進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，平均回收率在98.5%～101.3%，符合藥典要求.

2.3 樣品測(cè)定

取3批次供試品（20200501、20200502、20200503），按上述方法測(cè)定，四種有機(jī)溶劑殘留量測(cè)定結(jié)果見表3.3個(gè)批次中均只檢出環(huán)己烷，最高含量為10.5 μg·mL-1，低于限量值，符合藥典要求.

表3 3批次原料藥殘留溶劑的測(cè)定結(jié)果Tab.3 Contents of residual solvents in three batchers of methoprene

3 結(jié)果與結(jié)論

近年來，國(guó)家對(duì)原料藥生產(chǎn)過程中殘留溶劑嚴(yán)格管控，生產(chǎn)廠家在研發(fā)新藥的過程中在溶劑選擇上，不僅要考慮其作為反應(yīng)物、賦形劑及結(jié)晶溶劑等的作用效果，同時(shí)也要考慮最終脫溶劑后殘留溶劑含量能否達(dá)到藥典要求，本研究中的甲氧普烯在研發(fā)上由于吡啶、乙腈等溶劑殘留量無(wú)法達(dá)到藥典要求，曾多次更改生產(chǎn)工藝. 由此可見原料藥生產(chǎn)過程中要注意溶劑的選擇，關(guān)注最終產(chǎn)品溶劑殘留量是否能夠達(dá)到國(guó)家相關(guān)要求.

本研究首次對(duì)甲氧普烯中四種殘留溶劑進(jìn)行了定量檢測(cè)分析. 通過進(jìn)樣方式選擇、色譜柱分離條件優(yōu)化、頂空條件優(yōu)化等實(shí)驗(yàn)確定了準(zhǔn)確、高效、能滿足實(shí)際樣品分析檢測(cè)和質(zhì)量控制的要求.