(上海市金山區(qū)亭林醫(yī)院普外科,上海 201505)

甲狀腺結(jié)節(jié)是最常見的內(nèi)分泌疾病之一，發(fā)病率高達6%～7%，以良性結(jié)節(jié)多見[1-2]。已有研究顯示，甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)生是遺傳、免疫紊亂、激素失調(diào)等多種原因共同觸發(fā)而導致甲狀腺結(jié)構(gòu)及功能異常，其中甲狀腺細胞的增殖與凋亡平衡破壞在疾病的發(fā)生過程中起重要作用[3-4]。西醫(yī)治療甲狀腺結(jié)節(jié)常出現(xiàn)結(jié)節(jié)復發(fā)、骨質(zhì)疏松、甲狀腺功能下降等副作用[5-6]，而中醫(yī)藥具有毒小效優(yōu)、多環(huán)節(jié)、多途徑治療特點，在防治甲狀腺結(jié)節(jié)、改善癥狀、調(diào)節(jié)機體免疫等方面優(yōu)勢明顯[7]。消癭方以“益氣養(yǎng)陰、祛痰散結(jié)”為治則，為中藥治療“癭病”代表性方劑，臨床常用該方加減治療甲狀腺疾病。本研究旨在探討消癭方對甲狀腺FRTL細胞增殖與凋亡的影響，為中醫(yī)藥治療甲狀腺結(jié)節(jié)提供基礎理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級4周齡SD大鼠15只，雌雄不拘，體質(zhì)量200～220 g，由上海斯萊克動物有限公司提供。

1.1.2藥物 消癭方組方：黃芪30 g，玄參15 g，黨參15 g，白芍15 g，北沙參15 g，制香附15 g，浙貝母15 g，夏枯草10 g，當歸10 g，柴胡10 g，海浮石10 g，白芥子6 g，原藥材均購自上海群力中草藥店。全方加8倍體積水煎煮2次，并濃縮至人臨床等效劑量的0.5、1.0、2.0倍劑量。左甲狀腺素鈉片購自默克雪蘭諾有限公司，規(guī)格每粒50 μg。

1.1.3主要試劑與儀器 大鼠甲狀腺FRTL細胞株(武漢普諾賽)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco)；bax、bcl-2、caspase-3多克隆抗體(英國Abcam)；GAPDH單克隆抗體(美國CST)；HRP-IgG二抗(武漢博士德)；MTT粉末、Hoechst 33258染液(上海碧云天)；RIPA、Trizol(北京中杉金橋)；CO2培養(yǎng)箱、酶標儀(美國Thermo)；超微量核酸蛋白測定儀(英國BioDrop)；凝膠成像分析系統(tǒng)、實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)。

1.2 實驗方法

1.2.1含藥血清的制備SD大鼠隨機分為空白組、低濃度消癭方組、中濃度消癭方組、高濃度消癭方組和陽性藥組，每組3只。低、中、高濃度消癭方組分別給予7.47、14.94、29.88 g/kg的中藥復方煎液(相當于臨床等效劑量的0.5、1.0、2.0倍)，陽性藥組給予0.18 mg/kg(臨床等效劑量)左甲狀腺素鈉片水溶液，空白組則給予等量蒸餾水。各組均于每天上、下午固定時間灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃5 d。第6天上午灌胃完成后1 h麻醉大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置2 h，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，分裝、保存?zhèn)溆茫褂们坝?.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2.2細胞培養(yǎng) 取大鼠甲狀腺FRTL細胞株，用含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2飽和濕度下培養(yǎng)，待細胞基本長滿培養(yǎng)瓶底部(2～3 d)時消化傳代，取對數(shù)生長期細胞，隨機分為5組。 空白對照組(A組)：加入空白組血清；低濃度消癭方組(B組)：加入低濃度消癭方組含藥血清；中濃度消癭方組(C組)：加入中濃度消癭方組含藥血清；高濃度消癭方組(D組)：加入高濃度消癭方組含藥血清；左甲狀腺素鈉組(E組)：加入陽性藥組含藥血清。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1MTT法檢測細胞增殖率 采用胰蛋白酶消化并調(diào)整細胞密度，以每孔5 000個細胞接種于96孔板中，待細胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液，各組分別加入對應的含藥或者正常血清。每組設6個復孔，同時設置空白孔。分別于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h，加入MTT液避光孵育4 h，然后加入DMSO液，室溫下振蕩10 min，酶標儀測定450 nm波長處各孔的吸光度(A)值，計算細胞增殖率。增殖率(%)=(A含藥血清-A空白孔)/(A空白血清-A空白孔)×100%。

1.3.2Hoechst染色法檢測細胞凋亡情況 調(diào)整細胞密度，加入含藥或者正常血清后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出96孔板，棄去培養(yǎng)液，加入PBS液洗滌3次，然后每孔加入Hoechst 33258染液100 μL，37 ℃避光孵育30 min；孵育完成后，棄去孔內(nèi)染液，PBS液洗滌3次后，倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞的凋亡形態(tài)。

1.3.3Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達收集含藥或者正常血清培養(yǎng)24 h后的細胞，加入裂解液冰上裂解20 min，以4 ℃、12 000 r/min離心10 min后取上清液，應用超微量核酸蛋白測定儀測定細胞總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入稀釋后的一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。洗滌條帶，加入二抗(1∶500稀釋)室溫下孵育4 h，洗滌，化學發(fā)光法顯影。用Image-Pro Plus軟件分析各條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照，計算目的蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的相對表達水平。

1.3.4RT-PCR法檢測凋亡相關(guān)基因表達 收集含藥或者正常血清培養(yǎng)24 h細胞于EP管內(nèi)，加入1 mL Trizol試劑提取細胞總RNA，檢測含量合格后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求操作)，采用PCR擴增目的基因產(chǎn)物，以β-actin基因為內(nèi)參照。引物由深圳華大基因公司合成，序列見表1。用2-△△CT法對細胞目的基因bax、bcl-2、caspase-3水平進行定量分析。

以上指標檢測各組均用3份血清進行3次獨立重復實驗。

表1 基因引物及其序列

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組FRTL細胞增殖率比較

析因設計資料的多因素方差分析顯示，不同處理方式對FRTL細胞增殖率影響差異有顯著意義(F=12.40，P<0.01)，而相同處理方式不同時間處理對FRTL細胞增殖率沒有顯著影響(P>0.05)，且處理方式和處理時間無交互效應(P>0.05)。與空白對照組比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)能顯著降低FRTL細胞的增殖率(F=6.71、5.85，P<0.05)。與陽性藥左甲狀腺素鈉組比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細胞增殖率差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

表2 各組FRTL細胞增殖率比較

2.2 各組FRTL細胞凋亡形態(tài)觀察

空白對照組FRTL細胞密集、分布均勻，細胞形態(tài)正常，熒光呈暗藍色，無明顯的凋亡特征；中、低濃度消癭方組FRTL細胞數(shù)量稍有減少，但細胞形態(tài)、密度及熒光顏色與空白對照組比較差異不明顯；高濃度消癭方組及左甲狀腺素鈉組FRTL細胞數(shù)目明顯減少，排列散亂無規(guī)則，部分細胞核碎裂，細胞透亮，熒光顏色明顯，呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學特征。見圖1。

A：空白對照組；B：低濃度消癭方組；C：中濃度消癭方組；D：高濃度消癭方組；E：左甲狀腺素鈉組。Hoechst染色，200倍。

2.3 各組FRTL細胞凋亡相關(guān)蛋白表達比較

與空白對照組比較，中、高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)能顯著增加FRTL細胞促凋亡因子Bax蛋白的表達(F=9.97,P<0.01)，降低抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表達(F=14.73,P<0.01)，升高Bax/Bcl-2比值(F=63.20,P<0.01)，上調(diào)凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達(F=53.82,P<0.01)。與左甲狀腺素鈉組相比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細胞凋亡相關(guān)蛋白表達差異無顯著性(P>0.05)，而中濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后Bax/Bcl-2比值和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3表達降低(P<0.01)。與中濃度消癭方組比較，高濃度消癭方組Bax/Bcl-2比值和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達增高(P<0.01)。見圖2和表3。

A：空白對照組；B：低濃度消癭方組；C：中濃度消癭方組；D：高濃度消癭方組；E：左甲狀腺素鈉組。

表3 各組FRTL細胞凋亡相關(guān)蛋白表達比較

2.4 各組FRTL細胞凋亡相關(guān)基因表達比較

與空白對照組比較，中、高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)能顯著增加FRTL細胞促凋亡因子Bax基因表達(F=15.52,P<0.01)，降低抗凋亡因子bcl-2基因的表達(F=12.83,P<0.01)，升高基因bax/bcl-2比值(F=45.89,P<0.01)，上調(diào)凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3基因的表達(F=21.91,P<0.01)。與左甲狀腺素鈉組比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細胞凋亡相關(guān)基因表達差異無顯著意義(P>0.05)，而中濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細胞基因bax/bcl-2比值降低(P<0.01)。與中濃度消癭方組相比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細胞基因bax/bcl-2比值顯著增高，差異有顯著性(P<0.01)。見表4。

表4 各組FRTL細胞凋亡相關(guān)基因表達比較

3 討 論

甲狀腺結(jié)節(jié)屬中醫(yī)“癭病”范疇，病始在肝，肝氣郁滯而化火，灼傷津液而生痰，痰濁內(nèi)阻，瘀阻脈絡，以致氣機逆亂，氣血通行不暢，集結(jié)于頸部，導致此病發(fā)生[8]。其中醫(yī)病機關(guān)鍵是臟腑功能紊亂，氣血陰虛失和，氣滯、痰凝等有形之邪蘊結(jié)于局部而成癭腫，治當以“益氣養(yǎng)陰、祛痰散結(jié)”為法。

消癭方由黃芪、玄參、黨參、白芍、北沙參、制香附、浙貝母、夏枯草、柴胡、當歸、海浮石、白芥子等藥組成。方中以黃芪為君藥，益氣固表，消腫生肌，并能調(diào)節(jié)機體免疫及激素平衡；玄參、黨參、白芍、北沙參為臣藥，助黃芪益氣消腫之功效；制香附、浙貝母、夏枯草、柴胡、當歸、海浮石及白芥子為佐使藥，以行氣活血、消腫散瘀、養(yǎng)陰化痰、軟堅散結(jié)。諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰、祛痰散結(jié)兼扶正之功。臨床研究證實，消癭方治療甲狀腺結(jié)節(jié)、橋本甲狀腺炎等甲狀腺疾病療效顯著[9-11]。

甲狀腺細胞的正常增殖與凋亡是維持甲狀腺功能的基礎，細胞增殖速度過快以及細胞凋亡功能降低均參與了甲狀腺結(jié)節(jié)的形成過程[12]?；謴图谞钕偌毎鲋撑c凋亡的平衡，是治療該疾病的重要策略[13-14]。本實驗采用MTT法觀察消癭方對甲狀腺FRTL細胞增殖的影響，結(jié)果顯示，高濃度消癭方刺激的含藥血清能有效抑制FRTL細胞增殖；但其抑制FRTL細胞增殖效果不呈時間依賴性，因此后續(xù)研究中將干預時間設定為24 h。本文應用Hoechst 33258熒光染色法觀察細胞凋亡形態(tài)，結(jié)果顯示，高濃度的消癭方含藥血清能導致FRTL細胞數(shù)量下降，分布散亂，細胞核碎裂、固縮、透亮，呈現(xiàn)明顯的凋亡特征。

Bcl-2家族是目前公認與凋亡密切相關(guān)的基因，包括bax、bad等促凋亡因子和bcl-2、bcl-xl等抗凋亡因子基因，其中bax和bcl-2的相對表達水平高低直接決定細胞對凋亡刺激的反應程度[15-16]?？沟蛲鲆蜃觔cl-2主要是通過抗氧化或抑制氧自由基產(chǎn)生來阻止細胞凋亡，促凋亡因子bax則是通過線粒體途徑形成同源二聚體而誘導細胞凋亡，bax/bcl-2間的平衡決定細胞凋亡是否發(fā)生[17-20]。研究顯示，在甲狀腺結(jié)節(jié)疾病狀態(tài)下，抗凋亡的bcl-2表達增加而促凋亡的bax下降，導致bax/bcl-2比值異常，凋亡相對不足[21-23]。

Caspase家族是一組存在于細胞質(zhì)中具有特定結(jié)構(gòu)的蛋白酶，該家族相關(guān)蛋白的激活能誘發(fā)細胞凋亡，而Caspase家族成員的活性受到Bcl-2家族系列因子的調(diào)控[16,24]。其中，Caspase-3是Caspase家族中最關(guān)鍵的成員之一，是細胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行者[26]。本文研究結(jié)果顯示，消癭方含藥血清能有效增加促凋亡因子bax表達而降低抗凋亡因子bcl-2表達，打破促/抗凋亡因子bax/bcl-2間的平衡，同時上調(diào)caspase-3表達，從而誘導甲狀腺FRTL細胞凋亡。

綜上所述，以“益氣養(yǎng)陰、祛痰散結(jié)”為治則的消癭方能抑制甲狀腺FRTL細胞增殖，促進其凋亡，其機制可能與破壞促/抗凋亡因子bax/bcl-2間平衡、上調(diào)caspase-3表達有關(guān)。本研究從細胞層面明確了消癭方對甲狀腺疾病的治療作用，為該方的臨床應用提供了實驗依據(jù)。下一步擬對該方進行拆解，篩選并明確其發(fā)揮療效的有效成分。