(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266071)

肝細(xì)胞癌(HCC)是癌癥死亡的主要原因，其發(fā)病率逐年遞增[1]。HCC的治療主要包括手術(shù)切除、分子靶向治療和肝移植等[2]。然而，由于其具有惡性程度高以及術(shù)后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，許多國家HCC的發(fā)病率和死亡率還在持續(xù)上升[3]。盡管多項(xiàng)研究提出了包括病人的基本特征(如年齡和性別)和腫瘤相關(guān)因素(如腫瘤分級(jí))等在內(nèi)的預(yù)后因素，可用于預(yù)測HCC病人的生存狀態(tài)[4-5]，但是仍然缺乏有效的預(yù)后因素。自噬是一種高度保守的溶酶體降解途徑[6]，由一系列高度協(xié)同的信號(hào)通路調(diào)控，發(fā)生在所有細(xì)胞的基礎(chǔ)水平，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著重要作用[7-8]。研究結(jié)果顯示，自噬在多種疾病如癌癥、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等病理過程中起關(guān)鍵作用[9]。自噬參與調(diào)控HCC的進(jìn)程[10-11]。癌癥基因組圖譜(TCGA)計(jì)劃是通過大規(guī)模測序的基因組分析技術(shù)來繪制人類腫瘤的基因組圖譜[12]，其中包含33種癌癥[13-14]。本研究基于TCGA公共數(shù)據(jù)庫中HCC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息進(jìn)行分析，構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型并將其應(yīng)用于HCC的預(yù)后預(yù)測。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)資料收集及處理

研究涉及的數(shù)據(jù)資源下載于TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)，其中包括所有HCC病人RNA-seq數(shù)據(jù)及相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)。從人類自噬數(shù)據(jù)庫(HADb，http://www.autophagy.lu/)下載232個(gè)自噬相關(guān)基因(ATGs)。根據(jù)病人的ID號(hào)碼將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與病人的臨床信息進(jìn)行匹配，最終從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得了365例病人完整的生存信息和基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達(dá)的ATGs(DEATGs)的鑒定

利用edgeR函數(shù)包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以FDR<0.05和|fold change(FC)|>1為條件，篩選HCC組織和正常組織樣本中的差異表達(dá)基因(DEGs)以及DEATGs。

1.3 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R3.6.1軟件(https://www.R-project.org/)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖形繪制。采用Cox回歸分析風(fēng)險(xiǎn)比(HR)及其95%可信區(qū)間(CI)評(píng)價(jià)ATGs表達(dá)與預(yù)后的關(guān)聯(lián)。使用Cox回歸分析和LASSO回歸分析降維篩選模型相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)ATGs，構(gòu)建多基因預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。利用ROC曲線和AUC評(píng)估預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)測能力。采用單因素和多因素Cox回歸分析確定具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值的因素。利用Wilcoxon-signedrank檢驗(yàn)和Kruskal檢驗(yàn)分析臨床變量與ATGs的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DEATGs的篩選和富集分析

共篩選出12 471個(gè)DEGs(圖1A)，并進(jìn)一步從中篩選出62個(gè)DEATGs(圖1B)。對(duì)DEATGs進(jìn)行Gene Ontology(GO)分析，包括生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)。DEATGs在BP組中自噬和利用自噬機(jī)制的過程等方面顯著富集、CC組中空泡膜和膜區(qū)域等方面顯著富集、MF組中蛋白激酶調(diào)節(jié)活性和激酶調(diào)節(jié)活性等方面顯著富集(圖1C)。此外，KEGG通路分析顯示，DEATGs主要富集于自噬、細(xì)胞凋亡和人乳頭瘤病毒感染等方面(圖1D)。

2.2 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型風(fēng)險(xiǎn)ATGs的構(gòu)建

對(duì)62個(gè)DEATGs進(jìn)行單因素Cox回歸分析，共有40個(gè)與HCC預(yù)后顯著相關(guān)的ATGs納入后續(xù)的分析。經(jīng)過LASSO回歸分析降維，再使用多因素Cox回歸分析，最終得到了7個(gè)與HCC預(yù)后相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)ATGs(RAB7A、GAPDH、ATG9A、HSPA8、PRKN、TUSC1和FOS)，風(fēng)險(xiǎn)ATGs與HCC預(yù)后的關(guān)聯(lián)見圖2。利用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分函數(shù)構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=(RAB7A表達(dá)量×0.445 444 289)+(FOS表達(dá)量×0.217 687 513)+(ATG9A的表達(dá)量×0.542 642 682)+(HSPA8的表達(dá)量×0.218 555 915)+(PRKN的表達(dá)量×-0.727 657 489)+(TUSC1表達(dá)量×0.337 901 906)+(GAPDH表達(dá)量×0.246 856 663)。

2.3 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的評(píng)價(jià)

基于上述風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分函數(shù)生成每個(gè)病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，高風(fēng)險(xiǎn)組 182例，低風(fēng)險(xiǎn)組183例。隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的升高，病人的生存期縮短且死亡例數(shù)增加(圖3A)。Kaplan-Meier分析顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組病人的總體生存期較低(χ2=36.972,P<0.05)。ROC曲線分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型對(duì)HCC病人1～9年總生存期預(yù)測的AUC值分別為0.733、0.696、0.726、0.692、0.692、0.669、0.742、0.737和0.729(圖3B、C)。

A為12 471個(gè)DEGs熱圖，N為正常肝組織，T為HCC組織；B為62個(gè)DEATGs熱圖，N為正常肝組織，T為HCC組織；C為DEATGs GO分析；D為DEATGs KEGG分析。

A為LASSO回歸模型中采用10折交叉驗(yàn)證方法篩選出的14個(gè)ATGs；B為40個(gè)ATGs在LASSO模型中的回歸系數(shù)圖譜；C為多因素Cox分析篩選出來的7個(gè)風(fēng)險(xiǎn)ATGs。

2.4 ATGs預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值

單因素Cox回歸分析顯示，病人的腫瘤分期(HR=1.865,95%CI=1.456～2.388,P<0.05)、腫瘤浸潤深度(HR=1.804,95%CI=1.434～2.270,P<0.05)、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(HR=3.850,95%CI=1.207～12.281,P<0.05)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型(HR=3.029,95%CI=2.160～4.248,P<0.05)為預(yù)后預(yù)測因素。多因素Cox回歸分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是HCC病人的獨(dú)立預(yù)后因素(HR=2.574,95%CI=1.801～3.677,P<0.05)。見表1。

A為HCC高風(fēng)險(xiǎn)組、低風(fēng)險(xiǎn)組生存時(shí)間及7個(gè)風(fēng)險(xiǎn)ATGs表達(dá)分布圖；B為HCC高風(fēng)險(xiǎn)組、低風(fēng)險(xiǎn)組Kaplan-Meier分析；C為應(yīng)用ROC曲線對(duì)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行1～9年生存期的預(yù)測性能評(píng)價(jià)。

表1 Cox回歸分析評(píng)估ATGs和其他臨床變量在HCC病人中的預(yù)后價(jià)值

2.5 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的臨床應(yīng)用

為了檢驗(yàn)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測HCC進(jìn)展的能力，分析了風(fēng)險(xiǎn)因素(風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和風(fēng)險(xiǎn)基因)與臨床變量(生存狀態(tài)、年齡、性別、病理組織分級(jí)和病理TNM分期)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，隨著RAB7A、TUSC1和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分因素的增加，HCC病人生存狀態(tài)變差(t=-5.265～-2.175,P<0.05)，腫瘤浸潤深度增加(t=-3.613～-2.644，P<0.05)(圖4A～F)；隨著RAB7A、ATG9A、TUSC1和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的增加，HCC病人的病理分期增加(t=-3.737～-1.992，P<0.05)(圖4H～J)。高風(fēng)險(xiǎn)組病人自噬基因RAB7A、FOS、ATG9A、HSPA8、TUSC1和表達(dá)高于低風(fēng)險(xiǎn)組(t=3.848～7.467，P<0.05)(圖4L～Q)，PRKN基因表達(dá)低于低風(fēng)險(xiǎn)組(t=-3.741，P<0.05)(圖4R)。隨著FOS基因表達(dá)的增加，HCC病人病理組織分級(jí)明顯降低(t=3.542，P<0.05)(圖4K)。

A～C為RAB7A表達(dá)、TUSC1表達(dá)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與生存狀態(tài)關(guān)系；D～F為RAB7A表達(dá)、TUSC1表達(dá)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與浸潤深度關(guān)系；G～I(xiàn)為ATG9A表達(dá)、RAB7A表達(dá)、TUSC1表達(dá)與腫瘤分期、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤分期關(guān)系；K為FOS表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)關(guān)系；L～R為ATG9A表達(dá)、GAPDH表達(dá)、HSPA8表達(dá)、RAB7A表達(dá)、TUSC1表達(dá)、FOS表達(dá)、PRKN表達(dá)與風(fēng)險(xiǎn)模型關(guān)系。

3 討 論

HCC病人術(shù)后高復(fù)發(fā)率和化療藥物耐藥性的產(chǎn)生是肝癌病人病死率高的主要因素。因此，預(yù)測HCC預(yù)后的可靠分子標(biāo)志物對(duì)于指導(dǎo)病人的預(yù)后具有重要意義。業(yè)已證實(shí)，ATGs參與多種腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后，例如結(jié)直腸癌、膀胱癌和小細(xì)胞性肺癌等[15-17]。本研究結(jié)果顯示，ATGs與HCC的臨床病理特征和預(yù)后密切相關(guān)。本文通過對(duì)HCC腫瘤組織和正常組織DEGs表達(dá)的分析，篩選出62個(gè)DEATGs。GO分析顯示，DEATGs在BP組中自噬和利用自噬機(jī)制的過程等方面顯著富集、CC組中空泡膜和膜區(qū)域等方面顯著富集、MF組中蛋白激酶調(diào)節(jié)活性和激酶調(diào)節(jié)活性等方面顯著富集。KEGG富集分析顯示，DEATGs主要富集在自噬、細(xì)胞凋亡和人乳頭瘤病毒感染等方面。本文應(yīng)用單因素Cox回歸、LASSO回歸分析和多因素Cox回歸分析，確定7個(gè)風(fēng)險(xiǎn)ATGs(RAB7A、GAPDH、ATG9A、HSPA8、PRKN、TUSC1和FOS)構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型；Kaplan-Meier分析顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組的生存期明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組。本文還分析了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型中的因素與某些臨床特征的關(guān)系，研究結(jié)果顯示模型中的一些因素(如基因RAB7A、FOS、ATG9A、HSPA8、TUSC1和GAPDH表達(dá))的增加與HCC的病情進(jìn)展呈正相關(guān)。提示本文構(gòu)建的模型在預(yù)測HCC發(fā)展、演化等方面具有較高的臨床適用性，并為ATGs在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究提供了信息。

FOS是一種核原癌基因，編碼c-Fos，參與細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。有研究顯示，HCC組織中c-Fos高表達(dá)[18]。免疫組化研究顯示，HCC腫瘤組織中c-Fos的表達(dá)明顯高于非腫瘤組織[19]。本文研究結(jié)果表明，F(xiàn)OS與HCC病人預(yù)后相關(guān)，并隨著病理組織分級(jí)的增高，其表達(dá)量下降，提示FOS在HCC的進(jìn)展中可能發(fā)揮保護(hù)性作用，為進(jìn)一步研究提供了更多的信息。ATG9A是一種跨膜蛋白，可以促進(jìn)自噬體的形成[20]，有研究表明ATG9A在HepG2細(xì)胞中高表達(dá)[21]，而ATG9A基因的沉默則抑制膠質(zhì)瘤生長[22]。本文研究結(jié)果顯示，ATG9A與HCC病人預(yù)后相關(guān)，并隨著腫瘤分期的增加，其表達(dá)量升高，提示ATG9A是HCC發(fā)生發(fā)展的一個(gè)危險(xiǎn)因素。HSPA8是應(yīng)激蛋白，也是肝癌的早期生物標(biāo)志物，HSPA8高表達(dá)提示HCC復(fù)發(fā)[23]。本文研究結(jié)果顯示，HSPA8在高危組中的表達(dá)高于低危組，提示HSPA8是HCC發(fā)展過程中的危險(xiǎn)因素。SHIMIZU等[24]研究顯示，TUSC1基因內(nèi)高甲基化病人的疾病特異性生存期明顯短于未發(fā)生基因內(nèi)高甲基化者。本文研究結(jié)果顯示，TUSC1與HCC病人預(yù)后有關(guān)，隨著TUSC1表達(dá)的增加，HCC腫瘤分期升高、腫瘤浸潤深度增加，該結(jié)果提示TUSC1是HCC進(jìn)程中的一個(gè)危險(xiǎn)因素。另外有研究顯示，GAPDH在HCC病人中表達(dá)上調(diào)，GAPDH通過與3-BrPA或GAPDH shRNA的分子靶點(diǎn)作用阻斷腫瘤的進(jìn)展[25]。本文研究顯示，GAPDH在高危組中表達(dá)高于低危組，多因素Cox回歸分析顯示GAPDH是HCC的危險(xiǎn)因素。XIE等[26]研究發(fā)現(xiàn)，RAB7A影響體內(nèi)乳癌細(xì)胞增殖和遷移。PRKN通過抑制線粒體鐵介導(dǎo)的慢性炎癥和免疫功能障礙，顯著抑制KRAS驅(qū)動(dòng)的胰腺腫瘤的發(fā)生[27]。DUAN等[28]研究發(fā)現(xiàn)，PRKN通過EGFR/AKT/mTOR通路抑制肺癌的生長和轉(zhuǎn)移。但RAB7A和PRKN在HCC中的作用機(jī)制研究較少。本文研究單因素、多因素Cox回歸分析顯示，RAB7A和PRKN對(duì)于HCC病人的預(yù)后具有一定的預(yù)測作用，提示RAB7A和PRKN可能是HCC治療的潛在靶點(diǎn)，但這一結(jié)論需要大規(guī)模、多中心的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上,本研究通過ATGs表達(dá)譜分析,篩選出了7個(gè)(RAB7A、FOS、ATG9A、HSPA8、PRKN、TUSC1、GAPDH)與HCC病人的預(yù)后顯著相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)ATGs?；谶@7個(gè)風(fēng)險(xiǎn)ATGs組成的風(fēng)險(xiǎn)模型能夠很好地識(shí)別預(yù)后不良高風(fēng)險(xiǎn)的HCC病人,并且可以作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素預(yù)測HCC病人的預(yù)后?；诖私⒌念A(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)判斷HCC預(yù)后顯示出較高的準(zhǔn)確率。