肖 萍，張森雄，傅錦堅，梁卓信△

（柳州市婦幼保健院 1.藥學(xué)部；2.重癥醫(yī)學(xué)科；3.檢驗科，柳州 545001）

金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）是導(dǎo)致兒童皮膚和軟組織感染（skin and soft tissue in‐fection，SSTI）以及某些侵入性感染（如骨髓炎和敗血性關(guān)節(jié)炎）的最常見病原體之一[1]。同時，SA 也是健康兒童或醫(yī)療機構(gòu)相關(guān)的致病病原體之一[2]。SA廣泛存在于社區(qū)和醫(yī)療機構(gòu)相關(guān)環(huán)境，與其超強的毒力和耐藥基因傳播能力高度相關(guān)。據(jù)報道，不同的分子背景如攜帶的耐藥基因、毒力基因不同，其致病能力不一致，如在我國兒童醫(yī)院分離出來的常見克隆菌株ST59-SCCmecIV/V菌株，其大多呈現(xiàn)多重耐藥狀態(tài)，且殺白細(xì)胞素（Panton-Valentine leu‐kocidin，pvl）基因在甲氧西林耐藥性SA（methicillinresistantStaphylococcus aureus，MRSA）的攜帶率顯著高于甲氧西林敏感性SA（methicillin-sensitiveStaphylococcus aureus，MSSA）[3]。在兒童重癥監(jiān)護室（pediatric intensive care unit，PICU），SA 仍是引起PICU 嬰幼兒和兒童發(fā)生感染最常見的病原體之一[4-5]。但分離自該群體的SA 菌株的抗生素藥物耐藥性與分子遺傳背景的相關(guān)性分析較少，本研究旨在分析柳州地區(qū)PICU 兒童感染的SA 菌株抗生素藥物耐藥性與菌株的分子特征，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究人群和樣本收集 收集2018 年1 月至2019年12月在柳州市婦幼保健院PICU住院的嬰幼兒，在使用抗生素前采集臨床常見的感染性樣本如血液、腦脊液、深部痰液、肺泡灌洗液、膿液等標(biāo)本送至醫(yī)學(xué)檢驗科進行細(xì)菌的培養(yǎng)和鑒定。本研究獲得柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，批文為（20180013）。

1.2 SA 的分離鑒定 臨床非無菌體液樣本如深部痰液、肺泡灌洗液、膿液，接種于含5%羊血的哥倫比亞瓊脂平板、嗜血巧克力和麥康凱平板，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑選可疑陽性菌落進行革蘭染色、形態(tài)學(xué)等鑒定、純化，上機鑒定相關(guān)病原體。采集血液和腦脊液等無菌體液樣本放入血培養(yǎng)瓶或腦脊液孵育瓶上機孵育，待報警后進行涂片、革蘭染色、形態(tài)學(xué)等鑒定、增菌，再將單菌落上機鑒定相關(guān)病原體，確定分離株為SA。儀器選擇生物梅里埃的VITEK 2 COMPACT，鑒定卡片為AST-GP卡。

1.3 抗生素藥物敏感試驗和耐藥基因檢測 使用微量肉湯稀釋法進行抗生素藥物敏感試驗，檢驗結(jié)果的讀取基于美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會提出的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。儀器選擇生物梅里埃的VITEK 2 COMPACT，藥敏卡片為AST-GP67 卡。多重耐藥的判定標(biāo)準(zhǔn)為菌株對≥3 種不同型別的抗生素產(chǎn)生耐藥。此外，采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法檢測四環(huán)素耐藥基因（tetM和tetK）、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因（ermA和ermC）[6]。

1.4 SA 的分子特征分析 采用多序列基因分型（multilocus sequence typing，MLST）方法對SA 的7個管家基因進行測序后，將測序結(jié)果通過MLST 的數(shù)據(jù)庫（http://eburst.mlst.net）查詢得出序列分型（ST）和等位基因。使用網(wǎng)站自帶程序eBURST 確定特定ST 的克隆復(fù)合體（clonal complex，CC），單ST 指未能聚集成CC 的ST。使用PCR 方法檢測SA攜帶的甲氧西林耐藥性基因mecA，具體的mecA 基因分型參照文獻[7]執(zhí)行。使用PCR 法對SA 菌株的10 種毒素基因、pvl、免疫逃逸簇基因（immune eva‐sion cluster，IEC）(scn，chp，sak)和中毒性休克綜合征毒素-1（toxic shock syndrome toxin 1，tsst-1）進行檢測[8]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2驗驗或Fisher's 精確檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兒童SA 感染的臨床特征分析 共檢出57 例SA，其中MRSA 14 例，MSSA 43 例。住院前1 周內(nèi)有抗生素使用史的患兒MRSA 檢出率明顯高于MSSA患兒（P=0.005），見表1。

表1 兒童SA感染的特征分析

2.2 SA 菌株抗生素耐藥譜分析 所有的SA 菌株均對萬古霉素、利奈唑胺和左氧氟沙星敏感，MRSA菌株對氨芐西林、紅霉素、克林霉素和多重耐藥率顯著高于MSSA（均P＜0.05），見表2。

2.3 SA 菌株耐藥基因與毒力基因特征分析 四環(huán)素耐藥基因和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因和pvl、IEC 和tsst-1基因在MRSA與MSSA菌株間的分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表2 SA菌株抗生素耐藥性分析 n(%)

表3 SA菌株耐藥基因和毒力基因的特征分析

2.4 膿液與非膿液樣本分離的SA 菌株毒力基因比較 共從膿液樣本中檢出7 株SA，其攜帶的pvl基因和tsst-1基因顯著高于非膿液SA 菌株（P=0.003，P=0.021），見表4。

表4 膿液SA菌株毒力基因的特征分析

2.5 SA 菌株克隆型、耐藥基因和毒力基因的特征分析 57 株SA 菌株中共檢測出25 種ST，其中CC188、CC7、CC6 和CC5 是PICU 最常見的克隆株，共占總SA 菌株的47.4%。所有的14 株MRSA 菌株中，有10 株為SCCmecIV，4 株為SCCmecV，按照社區(qū)獲得性MRSA（Community-associated methicillinresistantS.aureus，CA-MRSA）的定義，均屬于CAMRSA。其中攜帶的SCCmecIVa元件的主要有ST6、ST25、ST89、ST108、ST509、ST946 和ST2832；攜 帶SCCmecV 元 件 的 主 要 有ST338、ST88 和ST121；攜帶SCCmecIV元件的主要有ST5、ST45 和ST59。

幾乎所有的SA 菌株均攜帶IEC 基因，某些SA菌株的分子背景呈現(xiàn)特異性，如3 株ST25 菌株均對紅霉素、克林霉素和四環(huán)素耐藥，且均攜帶ermC和tetK耐藥基因，均攜帶pvl基因。9 株MSSA-ST188菌株中，有4 株攜帶了tsst-1基因，表明本地區(qū)流行的SA 菌株呈現(xiàn)克隆多樣性和基因型分布的區(qū)域差異性，見表5。

3 討論

最近的多中心研究表明，各種弱勢人群的MRSA 感染率有所降低[9]。然而，兒科住院患兒MRSA 的感染率正呈現(xiàn)上升趨勢[10]。MRSA 是PI‐CU 住院的嬰幼兒感染的主要病原體之一[11]。由于宿主免疫系統(tǒng)不成熟，環(huán)境因素如侵入性設(shè)備的頻繁使用以及PICU 的相對擁擠環(huán)境，使得MRSA 容易定植和感染PICU 患者[12]。此前已有研究揭示了MRSA 感染的主要危險因素為醫(yī)療機構(gòu)接觸史、侵入性醫(yī)療設(shè)備使用史、兒童入院前抗生素用藥史等[13-14]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果類似，入院前一周曾經(jīng)使用抗生素，是PICU 患者獲得MRSA 感染的主要危險因素。

嬰幼兒SA 感染和MRSA 的抗菌藥物耐藥性已成為重要的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織（WHO）建議對出現(xiàn)嚴(yán)重細(xì)菌感染或敗血癥的嬰幼兒，可使用氨芐西林（或青霉素）與慶大霉素聯(lián)用，作為一線抗生素的首選[15]。但本研究結(jié)果顯示，PICU 分離的SA 菌株對青霉素的耐藥率達96.5%，對氨芐西林的耐藥率也達到了75.4%，這與最近我國報道的新生兒敗血癥中SA 對青霉素和氨芐西林的耐藥率分別為96.0%和78.0%的結(jié)果相符[16]。此外，本研究結(jié)果顯示，SA 菌株對慶大霉素的耐藥率約為5.3%，與廣州婦兒中心報道的0.8%的研究結(jié)果類似[17]，盡管WHO 建議使用氨芐西林外加氨基糖苷類抗生素治療金葡感染造成的膿毒血癥，但由于慶大霉素具有嚴(yán)重的耳毒性及腎毒性，臨床上基本慶大霉素基本不應(yīng)用于嬰幼兒及老人群體[15]。眾所周知，萬古霉素和利奈唑胺是少見的對于治療MRSA 有特效的抗生素之一，本研究結(jié)果顯示，所有的金葡菌菌株對萬古霉素和利奈唑胺均敏感，與廣州和我國大部分的研究結(jié)果一致[16-17]，表明萬古霉素和利奈唑胺仍是治療金葡菌感染的一線藥物之一。本研究結(jié)果顯示，有29.8%的SA 菌株呈現(xiàn)多重耐藥狀態(tài)，且MRSA 的多重耐藥性顯著高于MSSA 菌株（P＜0.05），研究結(jié)果與廣州婦兒中心報道的30.5%菌株為多重耐藥株的結(jié)果相似[17]，表明在兒童醫(yī)院的PI‐CU 病房，SA 菌株的多重耐藥已不能被忽視。醫(yī)護人員應(yīng)主動對PICU 感染菌株進行前瞻性監(jiān)測，尤其需要監(jiān)測多重耐藥性SA 菌株的流行模式和耐藥模式，以便正確指導(dǎo)抗生素的合理使用，降低PICU內(nèi)部流行的SA菌株多重耐藥性。

表5 SA菌株克隆型、耐藥基因和毒力基因的特征分析

SA的流行克隆株正在發(fā)生著動態(tài)的變化，包括SA 基因本身適應(yīng)性的地域差異和基因的水平轉(zhuǎn)移等[17]。對SA 進行分子特征的監(jiān)測或許會拓寬研究者對SA 菌株在PICU 環(huán)境和患者中傳播的機制認(rèn)識。本研究分離的57 株菌株中，共檢出了25 種ST型別，其中14 株MRSA 菌株按照國際上關(guān)于MRSA SCCmec的定義，均屬于CA-MRSA。14 株CAMRSA 分布于13 種ST 型別中。57 株SA 菌株最常見的基因型是CC188（ST188）、CC59（ST338 和ST59）、CC5（ST5）、CC6（ST6）、CC7（ST7）和CC88（ST8），在德國最常見的SA CC是CC15、CC8、CC25和CC7，但在美國分離的SA 主要CC 為CC30、CC5和CC8[15,18]。上述研究顯示SA菌株存在克隆多樣性和基因型分布的區(qū)域差異。本研究發(fā)現(xiàn)，ST188 是PICU 住院患兒群體分離的SA 菌株主要基因型別，與廣州婦兒中心的研究結(jié)果相似[17]，研究表明，由于具有較強的生物膜形成和粘附能力，使得ST188 仍是從中國兒童感染性樣本中分離出來的最常見MS‐SA 克隆。類似的報道在上海的人群和家畜樣本分離株已出現(xiàn)[19]，提示研究者需加強本地SA流行株如ST188的主動監(jiān)測，以期發(fā)現(xiàn)新的流行規(guī)律，更好的指導(dǎo)臨床針對型特異性進行主動干預(yù)。

本研究結(jié)果顯示，pvl基因主要存在于CC59、CC25、ST281 和ST2832 中，且導(dǎo)致PICU 兒童發(fā)生SSTI的主要克隆株為CC59、CC25。tsst-1基因主要在CC6、CC7、CC15、CC88、CC188 等CC 中檢出，且本研究發(fā)現(xiàn)，特定克隆株與耐藥模式或毒力基因之間存在的一定的對應(yīng)關(guān)系，如導(dǎo)致SSTI 感染的CC25對應(yīng)ermC和tetK耐藥基因，且攜帶pvl基因和IEC 的chp和sak。CC188 可導(dǎo)致SSTI，且容易攜帶tsst-1毒素、攜帶1 個或以上的IEC 基因（scn、chp和sak），這與早前溫州以及全國大型多中心研究的結(jié)果一致[20-21]，亦即ST25-pvl、ST188-tsst1存在相對應(yīng)關(guān)系，且pvl和tsst1是膿液分離的金葡菌攜帶最多的基因之一。揭示基于多種表型－基因型特征用于區(qū)分SA 克隆的必要性[22]，這為監(jiān)測SA 新的流行病學(xué)趨勢提供了另一種思路。

綜上所述，SA 的遺傳背景具有一定的特異性，提示在以后的研究中仍需對日常主動監(jiān)測發(fā)現(xiàn)的SA 菌株加以鑒定分析，以期發(fā)現(xiàn)新的流行病學(xué)趨勢。此外，從PICU 患者感染性樣本中分離的部分SA 菌株呈現(xiàn)多重耐藥性，也提示日后持續(xù)監(jiān)測SA菌株抗生素耐藥的重要性。