陸雅婷，蘇志恒，梁永紅

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021）

馬兜鈴酸類物質(zhì)（aristolochic acids，AAs）是常見于馬兜鈴科馬兜鈴屬和細辛屬植物中的硝基菲類化合物，主要包含馬兜鈴酸（aristolochic acid，AA）I、II、III 和IV 等組分，其中以AAI 的分布最為廣泛[1-3]。早在上個世紀(jì)，AAI 就被證實具有明顯的腎毒性，臨床上表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化、腎小管壞死，被冠以“馬兜鈴酸腎病”[4-5]。同時也有研究論證AAI作為潛在的致癌物質(zhì)，可引起腎癌、肝癌、淋巴癌等[6-8]。由于AAI 暴露所引起的全球公共衛(wèi)生問題引起了廣泛的關(guān)注，許多國家和地區(qū)叫停了馬兜鈴科中草藥及其制劑在臨床上的使用。然而，在中醫(yī)藥悠久的發(fā)展進程中，該類中草藥及其制劑在抗炎、抗瘧疾和降血糖方面表現(xiàn)出了舉足輕重的作用[9-11]。因此，如果能實現(xiàn)對中藥材中AAI 的捕獲、富集、去除將有助于達到減毒存效的目的，與此同時，建立AAI 快速檢測的方法也將進一步推動AAI的毒理學(xué)研究，有助于臨床上對“馬兜鈴酸腎病”的早期預(yù)防診斷，提高用藥安全性和有效性。

基于此，本研究以四氧化三鐵納米顆粒（Fe3O4）為載體，甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑，2,2－偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑制備AAI 磁性分子印跡聚合物（MIPs），依據(jù)該聚合物特異性吸附、易于分離等特點實現(xiàn)AAI快速富集以及專一、簡便檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AAI（批號：MUST-19031511，純度大于98%）購自成都曼思特生物科技有限公司；Fe3O4、MAA、AIBN、EGDMA、丙烯酰胺（AM）、硅酸四乙酯（TEOS）、3-（異丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（3-MPS）、2-乙烯吡啶（2-VP）均是分析純級別，購于上海阿拉丁試劑有限公司。質(zhì)譜級別乙腈和磷酸分別購于阿達瑪斯試劑有限公司和天津市大茂化學(xué)試劑廠。所有的實驗用水均通過凈水系統(tǒng)（Milli-Q）進行純化。實驗用的主要儀器有LC-1260Ⅱ型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；傅立葉變換紅外光譜儀（美國珀金埃爾默公司）；掃描電子顯微鏡（捷克TESCAN）；XS205DU 十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）；超聲清洗器（上海冠特超聲儀器公司）；離心機TDL-5A（上海菲恰爾分析儀器有限公司）。

1.2 AAI MIPs的制備

1.2.1 Fe3O4@SiO2顆粒的合成 將600 mg Fe3O4顆粒分散在60 mL 異丙醇-超純水（5∶1，v/v）的體系，超聲分散20 min，分別加入10 mL 氨水（25%，w/w）、4 mL TEOS，室溫反應(yīng)12 h，得到黑色產(chǎn)物。反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸住產(chǎn)物，除去溶劑。用超純水和甲醇反復(fù)洗滌數(shù)次以除去未反應(yīng)的試劑，最后得到Fe3O4@SiO2顆粒。將顆粒置于50 ℃的真空下干燥，備用。

1.2.2 Fe3O4@SiO2@MPS 顆粒的合成 將600 μL 3-MPS分散在120 mL含10%乙酸溶液的超純水中，室溫下持續(xù)機械攪拌5 h。上述溶液充分混勻后加入750 mg Fe3O4@SiO2顆粒，60 ℃下機械攪拌反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后用超純水將得到的產(chǎn)物洗滌直至中性，40 ℃的真空下干燥24 h，備用。

1.2.3 Fe3O4@SiO2@MPS@MIPs（MIPs）和Fe3O4@SiO2@ MPS@ NIPs（NIPs）的合成 將0.026 mmol的AAI 溶于40 mL 乙腈—甲醇（3∶1，v/v）的體系，充分溶解后加入0.104 mmol MAA，室溫下反應(yīng)5 h 形成預(yù)聚物，再將50 mg 的Fe3O4@SiO2@MPS、0.52 mmol EGDMA 和0.06 mmol AIBN 分散在上述溶液中?；旌先芤涸诔曉≈忻摎?5 min 后用氮氣鼓泡10 min 以除去氧氣。系統(tǒng)密封，在氮氣保護裝置下，65 ℃水浴反應(yīng)24 h。用磁鐵收集得到的黑色產(chǎn)物，依次用甲醇—乙酸溶液（9∶1，v/v）洗滌得到的聚合物，直至濾液通過HPLC檢測不到有AAI的存在。非分子印跡聚合物（non molecular imprinted poly‐mers,NIPs）的合成方法與MIPs的合成方法類似，只是不需要加入模板分子AAI。

1.3 合成條件的優(yōu)化

1.3.1 模板分子、功能單體和交聯(lián)劑比例的選擇 實驗中固定MAA為功能單體、EDGMA為交聯(lián)劑，考察模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的用量比例，分別為1∶4∶20、1∶2∶20、1∶6:20、1∶4∶10、1∶4∶40。

用印跡效率因子（IF）評價不同比例的印跡效率，定義為IF=QMIPs/QNIPs。其中QMIPs 和QNIPs 分別代表MIPs 和NIPs 的吸附容量，吸附量Q（μg/mg）采用下面公式計算：Q=（C0-C）×V/m,式中：C0和C分別為吸附前、后溶液中AAI 的濃度，單位μg/mL；V為加入的AAI 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的體積，單位mL；m 為加入MIPs或者NIPs的質(zhì)量，單位mg。

1.3.2 功能單體的選擇 根據(jù)“1.3.1”項實驗的結(jié)果固定模板分子、功能單體和交聯(lián)劑之間的用量比例，考察不同種類的功能單體對印跡效率的影響。實驗中選擇的功能單體有MAA、AM、2-VP，用IF評價不同功能單體的印跡效率。

1.3.3 溶劑的選擇 溶劑又稱致孔劑，在MIPs的制備過程中溶劑應(yīng)有助于模板分子和其他反應(yīng)物的溶解，從而使聚合物具有孔狀結(jié)構(gòu)，便于模板分子進入識別位點。常用的溶劑種類有乙腈、甲醇、丙酮、氯仿等，在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)AAI 易溶于乙腈-甲醇（3∶1,v/v）、丙酮、氯仿，因此本次實驗考察以上幾個溶劑種類對印跡效率的影響，用IF 評價不同溶劑的印跡效率。

1.4 MIPs和NIPs的表征

采用掃描電鏡（SEM）、傅立葉紅外變換光譜儀（FT-IR）表征得到的MIPs和NIPs形貌以及結(jié)構(gòu)。

1.5 AAI MIPs吸附性能的研究

1.5.1 AAI 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱定15 mg AAI于50mL 容量瓶中并用甲醇溶解定容，配成300 μg/mL AAI 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。再依次量取適量儲備液，配成25～200 μg/mL AAI標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5.2 AAI 在C18柱上的色譜測定條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相條件：0.1%磷酸水溶液:乙腈=50∶50；流速：1.0 mL/min；檢測器：紫外檢測器；進樣體積:10 μL；檢測波長：250 nm。

1.5.3 MIPs 和NIPs 的靜態(tài)吸附試驗將20 mg 的MIPs 或者NIPs 放置于10 mL 離心管，管內(nèi)加入1.5 mL 甲醇，超聲分散30 min 后加入2.5 mL 不同濃度的AAI 標(biāo)準(zhǔn)溶液。室溫條件下將所有的離心管放置在恒溫回旋振蕩器振蕩12 h，1 000 r/min 離心3 min 后再次用超聲儀分散3 min。用磁鐵移除MIPs 或者NIPs，取離心管上清液過0.22 μm 濾膜，用HPLC測定吸附后溶液中AAI的濃度。

1.5.4 MIPs 和NIPs 的動態(tài)吸附試驗 將20 mg 的MIPs 或者NIPs 放置于10 mL 離心管，管內(nèi)加入1.5 mL甲醇，超聲分散30 min后加入2.5 mL 200 μg/mL 的AAI 標(biāo)準(zhǔn)溶液。室溫條件下將所有的離心管放置在恒溫回旋振蕩器，分別振蕩5 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，1 000 r/min離心3 min 后再次用超聲儀分散3 min。用磁鐵移除MIPs 或者NIPs，取離心管上清液過0.22 μm 濾膜，用HPLC測定吸附后溶液中AAI的濃度。

2 結(jié)果

2.1 AAI MIPs的制備

AAI MIPs 可以高度分散在超純水中（圖1a）。在外部磁鐵的吸附下，黑色固體可以迅速聚集，從而達到固體、液體完全分離的效果（圖1b）。固液分離的過程可以在10 s內(nèi)完成。

2.2 合成條件的優(yōu)化

2.2.1 模板分子、功能單體和交聯(lián)劑比例的選擇當(dāng)模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的物質(zhì)的量比為1∶4∶20時，AAIMIPs的印跡效果最好，見表1。

圖1 合成的AAI MIPs在超純水中的分散情況（a）和固液分離情況（b）

表1 模板分子、功能單體和交聯(lián)劑不同物質(zhì)的量比對AAI的印跡效率的影響

2.2.2 功能單體的選擇 以MAA 作為功能單體得到的印跡效率明顯高于選擇AM 和2-VP 作為功能單體，見表2。

表2 不同種類的功能單體對AAI的印跡效率

2.2.3 溶劑的選擇 以乙腈—甲醇（3∶1，v/v）作為實驗的溶劑體系，可以獲得較高的印跡效率，見表3。

表3 不同種類的溶劑對AAI的印跡效率

2.3 MIPs和NIPs的表征

從圖2可以看到合成的兩種粒子均近似球形團簇在一起，個體圓滑，粒徑基本一致。圖3 是MIPs和NIPs 的紅外光譜圖，二者的特征峰形基本一致，說明AAI 已經(jīng)成功從聚合物中洗脫。圖3 中1 082.94 cm-1、1 092.65 cm-1吸收峰屬于Si-O-Si 的反對稱伸縮振動，證明了硅烷偶聯(lián)劑成功偶聯(lián)在了Fe3O4納米顆粒的表面，形成硅層；2 916.51 cm-1、2 920.96 cm-1振動峰對應(yīng)于3-MPS 中C-H 的伸縮振動，說明雙鍵基團成功接枝在Fe3O4@SiO2，為在其表面制備MIPs提供了條件。

圖2 MIPs（a）和NIPs（b）的SEM 圖

圖3 MIPs和NIPs的紅外光譜圖

2.4 AAI MIPs吸附性能的研究

2.4.1 AAI標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 配制系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的AAI 溶液后利用HPLC 進行檢測，得到AAI 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖4 所示，在25～200 μg/mL 范圍內(nèi)溶液濃度與峰面積之間有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=5100.7CAAI+3739.6，其中CAAI為AAI 的濃度，相關(guān)系數(shù)R2為0.9996。

2.4.2 MIPs 和NIPs 的靜態(tài)吸附試驗 吸附量Q 與AAI 吸附濃度之間的關(guān)系曲線如圖5 所示。對于MIPs，在AAI 濃度為25～75 μg/mL 范圍內(nèi)吸附量大體保持恒定，在75 μg/mL 之后隨著AAI 濃度的增大，MIPs 的吸附量增大。該現(xiàn)象體現(xiàn)MIPs 對AAI存在物理吸附和特異性吸附兩種性能。對于NIPs，其不存在AAI 特異性識別位點，對AAI 只有物理吸附，所以吸附效果顯著差于MIPs。

圖4 AAI的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖

圖5 同一吸附時間MIPs、NIPs對不同濃度的AAI吸附容量

2.4.3 MIPs 和NIPs 的動態(tài)吸附試驗 在不同時間點吸附量Q 與AAI 吸附濃度之間的關(guān)系如圖6 所示。MIPs對AAI明顯存在較高的吸附速度，且隨著吸附時間的延長，MIPs 對AAI 的吸附量逐漸增大。在實驗時間內(nèi)，NIPs 對AAI 的吸附量大體保持恒定，未表現(xiàn)出良好的吸附性能。

圖6 不同吸附時間MIPs、NIPs對同一濃度的AAI吸附容量

3 討論

3.1 AAI MIPs的制備

Fe3O4納米顆粒有以下特點：低毒性、良好的生物相容性、順磁性[12]，其中，利用Fe3O4的磁性結(jié)合分子印跡聚合物的特異識別性可以對模板分子進行快速分離，所以本次研究首選Fe3O4作為載體材料。為了更好地形成表面印跡層，本研究還參考現(xiàn)有文獻對Fe3O4進行一定的修飾[13]，即在磁球表面用硅殼進行改性，再進一步經(jīng)溶膠－凝膠反應(yīng)加入3-MPs在Fe3O4@SiO2表面形成雙鍵基團。這樣的修飾不僅可以提高納米粒子的分散性，減少團聚現(xiàn)象，提高其可重復(fù)利用性，也使其更易于進行下一步的修飾，增加了磁性納米粒子的應(yīng)用范圍。同時，雙鍵基團的引入為模板分子與功能單體的聚合提供活性位點，更易于對AAI 的吸附。通過利用SEM、FTIR 表征得到的產(chǎn)物，確證了成功制備AAI MIPs，該聚合物不僅能對AAI 有吸附作用，還在外部磁鐵的作用下快速實現(xiàn)了固液分離，說明所制備的AAI MIPs 保留有載體材料的磁性，同時也展現(xiàn)出MIPs對目標(biāo)分析物的高強吸附性。

3.2 AAI MIPs合成條件的優(yōu)化

實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選擇EGDMA 為交聯(lián)劑，MAA 作為功能單體，乙腈－ 甲醇作為溶劑，且AAI∶MAA∶EGDMA 物質(zhì)的量比例為1∶4∶20 時，IF 為3.11，產(chǎn)生較好的印跡效果。EGDMA 可以通過AIBN 與MAA 形成良好的交聯(lián)，從而將MAA 的功能基團在空間排列和空間方向上固定下來，更好的讓AAI 鑲嵌其中形成復(fù)合物。MAA 可以與AAI 發(fā)生較強的分子間作用力，形成氫鍵。氫鍵具有方向性和飽和性，可以采用物理或化學(xué)的方法將其斷裂，將AAI完全從復(fù)合物中洗脫。AAI易溶于乙腈、甲醇、乙醇等有機溶劑中[14]，所以以乙腈－甲醇作為反應(yīng)溶劑可以讓AAI 高度分散其中，有利于AAI 與MAA 相互結(jié)合，形成均一穩(wěn)定的復(fù)合物。一般而言增大功能單體的比例可以充分地預(yù)組裝印跡分子，但過大濃度的功能單體有可能因為自身的聚合而減少特異性結(jié)合位點[15]。參照文獻，模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的物質(zhì)的量比以1∶4∶20為宜[16]，本次研究的結(jié)果也表明在這個條件下對AAI 有最大吸附效率。IF是評價MIPs印跡性能的重要參數(shù)，李小燕課題組制備的MIPs 以青蒿素為模板分子，其IF為2.16，對青蒿素表現(xiàn)出顯著的吸附效果[17]；陳朗星等[18]以萘夫西林作為模板分子制備MIPs，其IF 為2.46，對萘夫西林有較高的吸附容量；本研究中得到的MIPs，其IF為3.11，與既往研究的結(jié)果比較，印跡效率因子更大，說明印跡效率更高。

3.3 AAI MIPs吸附性能的研究

在靜態(tài)吸附實驗中MIPs 的吸附量隨AAI 濃度的增加而增加，動態(tài)吸附實驗中發(fā)現(xiàn)MIPs的吸附量隨吸附時間的增加而增加，且兩個實驗中均呈現(xiàn)NIPs 對AAI 的結(jié)合量明顯低于MIPs。二者吸附差異的原因是NIPs 對AAI 的吸附是物理吸附，MIPs因內(nèi)部有很多對AAI 的結(jié)合位點，因此其對AAI 的吸附量明顯增大。這也進一步說明了合成MIPs 對AAI 具有較高吸附容量，有望應(yīng)用于實際樣品中AAI的富集和分析。