龐旭姣，呂向坤，魏杏茹

（1.河北省第七人民醫(yī)院，定州 073000；2.中國人民解放軍陸軍第八十二集團軍醫(yī)院，保定 071000；3.河北省保定市婦幼保健院，保定 071000）

宮頸癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)報道，局部早期宮頸癌治愈率達90%，但晚期宮頸癌具有較高的遷移率和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，其中位生存時間僅8～13 個月，預(yù)后較差[1-2]。目前對于晚期復(fù)發(fā)及預(yù)后差的宮頸癌仍缺乏有效的治療方法，因此，進一步揭示宮頸癌的分子機制，發(fā)掘新的分子靶向治療靶點非常重要。

環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNAs）是一種新的非編碼RNA，因其具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)、表達穩(wěn)定等特點而成為近年來疾病研究中的熱點[3]。miRNA是一類長度約22 個核苷酸的非編碼RNA，是腫瘤發(fā)生、進展及預(yù)后的重要調(diào)控因子。近年來多項證據(jù)表明，circRNA 可競爭性結(jié)合miRNAs，進而解除miRNAs 對其靶基因的調(diào)控作用，參與腫瘤進展[4]。研究報道，circ_0000285 在宮頸癌中高表達，發(fā)揮促癌作用[5]，但其作用分子機制尚未完全闡明。因此，本研究旨在分析circ_0000285 對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本 收集2018 年1 月至2020 年1 月在河北省第七人民醫(yī)院進行腫瘤根治術(shù)治療的50 例宮頸癌患者的宮頸癌組織和癌旁正常組織樣本，所有的宮頸癌患者均經(jīng)組織病理診斷確診，術(shù)前未接受放療、放療等輔助治療。本研究所有實驗均獲得醫(yī)院倫理委員會的批準，樣本采集均獲得患者及其家屬的同意。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人卵巢上皮細胞株HOSEp‐iC 和宮頸癌細胞株OVCAR-3、A2780 和SiHa 由中國科學院上海細胞庫提供。接種于含有1%青鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d 更換一次培養(yǎng)液，直到細胞達到對數(shù)生長期。

消化、收集對數(shù)生長期的OVCAR-3 細胞，將細胞分為以下幾組：（1）Blank 組：細胞未經(jīng)任何處理；（2）si-NC 組：細胞轉(zhuǎn)染siRNA NC（si-NC）；（3）sicirc_0000285 組：細胞轉(zhuǎn)染siRNA circ_0000285（sicirc_0000285）；（4）si-circ_0000285+anti-NC組：細胞共同轉(zhuǎn)染siRNA circ_0000285（si-circ_0000285）和miRNA inhibitor 陰性對照（anti-NC）；（5）si-circ_0000285+anti-miR-637 組：細胞共同轉(zhuǎn)染siRNA circ_0000285（si-circ_0000285）和miR-637 inhibitor（anti-miR-637）；（6）miR-NC 組：細胞轉(zhuǎn)染miRNA mimics 陰性對照（miR-NC）；（7）miR-637 組：細胞轉(zhuǎn)染miR-637 mimics；（8）miR-637+pcDNA 組：細胞共同轉(zhuǎn)染miR-637 mimics 和pcDNA3.1空載體；（9）miR-637+信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）重組過表達質(zhì)粒（pcDNA-STAT3）組：細胞共同轉(zhuǎn)染miR-637 mimics 和pcDNA3.1-STAT3。細胞轉(zhuǎn)染使用Li‐pofectamine 3000試劑，轉(zhuǎn)染48 h后用于后續(xù)實驗。

1.3 RT-qPCR 法檢測circ_0000285、miR-637 及STAT3 表達使用 TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）從組織樣本和各細胞株中提取總RNA，使用PrimerScript RT 試劑試劑盒（中國Takara 公司）將純化的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYRB Green 法，使用ABI 7500 型實時熒光定量PCR 儀進行PCR 擴增反應(yīng)。以GAPDH 作為circ_0000285 和STAT3 mRNA 的內(nèi)參，U6 作為miR-637 的內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。引物序列：GAP‐DH 上游5’-CTCTCTGCTCTCCTGTTCGAC-3’，下游 5’-TGAGCGATGTGGCTCGGCT-3’；circ_0000285 上 游5’-TATGTTGGTGGATCCTGTTCG‐GCA-3’，circ_0000285 下游5’-TGGTGGGTAGAC‐CAAGACTTGTGA-3’；STAT3 mRNA 上游5’-GCATTACGCTTAAGGCCTA-3’，STAT3 mRNA 下 游5’-CAATGGGCACTCCGGGATCG-3’；miR-637 上游5’-ACUGGGGGCUUUCGGGCUCUGCGU-3’，miR-637 下游5’-ACGCAGAGCCCGAAAGCCCCCAGU-3’；U6 上游5’-CGCTTCGGCAGCACATAT‐TAC-3’，U6 下 游5’-TTCACGAATTTGCGTGTC‐CAT-3’。

1.4 CCK8實驗檢測細胞增殖活性 收集對數(shù)生長期的OVCAR-3細胞，調(diào)整細胞密度為5×104個細胞/mL。在96 孔板中接種100 μL 的細胞懸液，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，加入10 μL CCK8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標儀測定在450 nm處的吸光度（OD）值。

1.5 Transwell 實驗檢測細胞遷移和侵襲 取150μL 細胞懸液接種到Transwell 板的上室中，然后在下室加入600 μL 含血清的DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell上室用濕棉簽將上室上表面的細胞擦除，然后在甲醇中固定30 min，0.1%結(jié)晶紫中染色15 min，使用PBS 溶液沖洗Transwell 上室，室溫下晾干后，使用顯微鏡觀察并隨機計數(shù)5 個視野區(qū)的細胞遷移數(shù)目。細胞侵襲實驗在Transwell 板的下室中提前加入Matrigel 基質(zhì)膠（美國BD 公司），待Matrigel 基質(zhì)膠凝固后同上述步驟一樣檢測細胞遷移數(shù)目。

1.6 Western blotting 法檢測 使用RIPA 裂解法從細胞中提取總蛋白，蛋白樣本測濃度后在沸水中變性，然后以50 μg 的上樣量進行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），采用濕轉(zhuǎn)法將電泳分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用含10%脫脂奶粉的TBST 溶液封膜2 h；將膜分別與STAT3 蛋白一抗稀釋液（稀釋比例1∶2 000）和β-actin 蛋白一抗稀釋液（稀釋比例1∶1 000）在4 ℃下過夜孵育，洗膜；與辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液（稀釋比例1∶1 000）在室溫下孵育1 h，洗膜；在化學發(fā)光液中孵育2 min，曝光、拍照。STAT3蛋白抗體、β-actin蛋白抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Ab‐cam公司。

1.7 雙熒光素酶報告基因試驗 分別將含有miR-637 結(jié)合序列的circ_0000285 序列（circ_0000285-WT）及其突變序列（circ_0000285-MUT）、STAT3 3’UTR 序 列（STAT3 3’UTR-WT）及其突變序列（STAT3 3’UTR-MUT）構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體，然后分別與miR-NC 和miR-637 共轉(zhuǎn)染OV‐CAR-3 細胞，轉(zhuǎn)染48 h 后使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞中熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料均以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析檢驗，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 circ_0000285在宮頸癌組織和細胞中高表達 與癌旁正常組織（1.00±0.08）比較，circ_0000285 在宮頸癌組織中表達（2.52±0.37）明顯升高（P＜0.05）；與人正常宮頸癌上皮細胞HOSEpiC（1.00±0.08）比較，circ_0000285 在宮頸癌細胞OV‐CAR-3（3.79±0.51）、A2780（2.98±0.36）和SiHa（2.17±0.29）中表達明顯升高（P＜0.05）。

2.2 敲減circ_0000285 抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲 與Blank 組和si-NC 組比較，si-circ_0000285 組細胞中circ_0000285 相對表達量明顯降低（P＜0.05），說明siRNA circ_0000285 轉(zhuǎn)染成功。細胞功能實驗結(jié)果顯示，與Blank 組和si-NC 組比較，si-circ_0000285 組細胞培養(yǎng)48 h 和72 h 時細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05），細胞培養(yǎng)24 h時細胞遷移和侵襲數(shù)目明顯減少（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 Transwell檢測細胞遷移和侵襲

表1 敲減circ_0000285對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響 ±s

表1 敲減circ_0000285對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響 ±s

與Blank組比較，*P＜0.05；與si-NC組比較，#P＜0.05。

2.3 circ_0000285 靶向miR-637 本研究通過生物信息學網(wǎng)站Circinteractome 預(yù)測到circ_0000285 與miR-637 具有結(jié)合位點（圖2A）；雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，與miR-NC+circ_0000285 WT 共轉(zhuǎn)染組比較，miR-637+circ_0000285 WT 共轉(zhuǎn)染組細胞中熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05，圖2B），說明circ_0000285能夠與miR-637靶向結(jié)合；qRT-PCR結(jié)果顯示，與Blank組和si-NC組比較，si-circ_0000285組細胞中miR-637 相對表達量明顯升高（P＜0.05，圖2C），說明敲減circ_0000285 靶向抑制細胞中miR-637的表達。

2.4 circ_0000285 靶向miR-637 調(diào)控宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲 與si-NC組比較，si-circ_0000285組細胞培養(yǎng)48 h 和72 h 時細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05），細胞培養(yǎng)24 h時細胞遷移和侵襲數(shù)目明顯減少（P＜0.05）；與si-circ_0000285+anti-NC 組比較，si-circ_0000285+anti-miR-637 組細胞培養(yǎng)48 h和72 h時細胞增殖活性明顯增強（P＜0.05），細胞培養(yǎng)24 h時細胞遷移和侵襲數(shù)目明顯增多（P＜0.05），見表2，圖3。

圖2 circ_0000285靶向miR-637

圖3 Transwell檢測細胞遷移和侵襲

2.5 circ_0000285靶向miR-637調(diào)控STAT3的表達 本研究通過生物信息學網(wǎng)站TargetScan 預(yù)測到miR-637 與STAT3 3’UTR 具有結(jié)合位點（圖4A）；雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，與miR-NC+STAT3 3’UTR WT 共轉(zhuǎn)染組比較，miR-637+STAT3 3’UTR WT 共轉(zhuǎn)染組細胞中熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05，圖4B），說明miR-637 能夠與STAT3 的3’UTR靶向結(jié)合；RT-qPCR 和Western blot 結(jié)果顯示，與si-NC 組比較，si-circ_0000285組細胞STAT3 mRNA 和蛋白相對表達量明顯降低，與si-circ_0000285+anti-NC 組比較，si-circ_0000285+anti-miR-637 組細胞中STAT3 mRNA 和蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），見表3、圖5。

表2 細胞增殖、遷移和侵襲檢測 ±s

表2 細胞增殖、遷移和侵襲檢測 ±s

與si-NC組比較，*P＜0.05；與si-circ_0000285+anti-NC組比較，#P＜0.05。

圖4 miR-637靶向STAT3

圖5 Western blotting檢測細胞中STAT3蛋白表達

2.6 miR-637 靶向STAT3 調(diào)控宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲 Western blotting 實驗結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-637組細胞中STAT3 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）；與miR-637+pcDNA 組比較，miR-637+pcDNA-STAT3 組細胞中STAT3 mRNA 和表蛋白達水平均明顯升高（P＜0.05），見圖6，表4。

表3 circ_0000285通過miR-637調(diào)控STAT3的表達 ±s

表3 circ_0000285通過miR-637調(diào)控STAT3的表達 ±s

與si-NC 組比較，*P＜0.05；與si-circ_0000285+anti-NC 組比較，#P＜0.05。

與miR-NC組比較，miR-637組細胞培養(yǎng)48 h和72 h時細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05），細胞培養(yǎng)24 h時細胞遷移和侵襲數(shù)目明顯減少（P＜0.05）；與miR-637+pcDNA 組 比 較，miR-637+pcDNA-STAT3組細胞培養(yǎng)48 h 和72 h 時細胞增殖活性明顯增強（P＜0.05），細胞培養(yǎng)24 h時細胞遷移和侵襲數(shù)目明顯增多（P＜0.05），見圖7，表5。

圖6 Western blotting檢測細胞中STAT3蛋白表達

表4 miR-637調(diào)控STAT3的表達 ±s

表4 miR-637調(diào)控STAT3的表達 ±s

與miR-NC 組比較，*P＜0.05；與miR-637+pcDNA 組比較，#P＜0.05。

圖7 Transwell檢測細胞遷移和侵襲

表5 miR-637通過STAT3對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響 ±s

表5 miR-637通過STAT3對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響 ±s

與miR-NC組比較，*P＜0.05；與miR-637+pcDNA組比較，#P＜0.05。

3 討論

近年來越來越多的證據(jù)表明，circRNA 與腦血管性疾病、炎癥性疾病、神經(jīng)性疾病等多種人類疾病有關(guān)，尤其與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6-8]。circ_0000285 是一種癌相關(guān)的circRNA，Yang、Qin 等[9-10]報道，circ_0000285 在甲狀腺癌和喉癌中高表達，其過表達可增強癌細胞的增殖轉(zhuǎn)移能力。但目前circ_0000285 在宮頸癌中病理作用機制尚不完全清楚。本研究結(jié)果證實circ_0000285 在宮頸癌組織和細胞中高表達，與Chen 等[12]研究結(jié)果一致。細胞功能實驗結(jié)果表明，敲除circ_0000285 能夠抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，證實了circ_0000285在宮頸癌進展中發(fā)揮癌基因的作用。

功能研究表明，circRNA 作為miRNA 海綿是其參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制，如Song 等[11]報道，下調(diào)circ_101996 通過調(diào)控miR-8075 及其靶基因表達，抑制宮頸癌進展；Chen等[12]報道，下調(diào)circMTO1通過miR-6893 及其靶基因抑制宮頸癌細胞的轉(zhuǎn)移和化療耐藥性。miR-637 是一種抑癌相關(guān)的miR‐NA，被報道在宮頸癌中發(fā)揮抑癌作用[13]。本研究通過在線生物信息學數(shù)據(jù)庫預(yù)測到circ_0000285 與miR-637 具有結(jié)合位點，并針對該結(jié)合位點設(shè)計合成雙熒光素酶質(zhì)粒，結(jié)果證實circ_0000285 可與miR-637靶向結(jié)合，在宮頸癌細胞中過表達miR-637后，細胞的增殖、遷移和侵襲均得到抑制，與敲除circ_0000285的作用效果一致，而抑制miR-637則能逆轉(zhuǎn)circ_0000285 的功能，提示circ_0000285 通過競爭性結(jié)合miR-637影響宮頸癌細胞的惡性生物學行為。

STAT3是一類DNA結(jié)合蛋白，因其能夠介導細胞的惡性轉(zhuǎn)化而被認為是一種癌基因[14]。功能研究表明，miRNA 可通過與靶基因3’UTR 區(qū)結(jié)合實現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而調(diào)控相關(guān)疾病的發(fā)生和進展[15]。本研究結(jié)合生物信息學分析與熒光素酶實驗證實miR-637 可與STAT3 的3’UTR 靶向結(jié)合，并證實宮頸癌細胞中敲除circ_0000285 或過表達miR-637 均能夠抑制STAT3 的mRNA 和蛋白表達，而抑制miR-637 則能逆轉(zhuǎn)circ_0000285 對STAT3 mRNA 和蛋白表達的影響，說明circ_0000285 可通過靶向miR-637調(diào)控細胞中STAT3基因表達。細胞功能實驗結(jié)果，過表達STAT3 能夠逆轉(zhuǎn)miR-637 對細胞增殖、遷移和侵襲的影響。提示circ_0000285作為miR-637 的海綿，通過進一步調(diào)控其靶基因STAT3 的表達，影響宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究證實了circ_0000285 可通過競爭性結(jié)合miR-637，間接調(diào)控其靶基因STAT3 的表達，調(diào)控宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程。circ_0000285/miR-637/STAT3 軸為宮頸癌的發(fā)生機制提供了新的思路，提示circ_0000285 作為宮頸癌潛在治療靶點的可能性。