郭 玥，王倩怡，莫祎祎，宋 慧，梁永紅，蘇志恒

（廣西醫(yī)科大學藥學院，南寧 530021）

抑郁癥又稱抑郁障礙癥，其臨床癥狀表現(xiàn)為情緒低落，意志減退、軀體障礙、悲觀厭世等，嚴重者可能出現(xiàn)自殺傾向并付諸行動[1]。世界衛(wèi)生組織調查發(fā)現(xiàn)，全球抑郁癥患者已達3.22 億，中國抑郁癥患病率約4.2%[2]。近年來，抑郁癥的患病年齡呈下降趨勢，越來越多的青少年罹患此癥，目前臨床常用的抗抑郁藥物如三環(huán)類抗抑郁藥(TCAs)、單胺氧化酶抑制劑(MAOIs)等均可控制癥狀，但該藥物具有依從性和多種副作用（如依賴責任、精神運動障礙）。牛大力，為豆科蝶形花亞科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤Millettia speciosaChamp.的干燥根，味甘性平，具補虛潤肺、強筋活絡之效[3-4]。牛大力主要分布于廣東、廣西等地，常用于制作藥膳、藥酒等[5-10]，為嶺南地區(qū)著名的藥食兩用植物[11]?，F(xiàn)代藥理研究表明，牛大力具有提高免疫功能、保肝、祛痰、鎮(zhèn)咳、平喘、抗氧化、抗炎、抗腫瘤以及抗應激等作用[12-14]。課題組前期也有研究過牛大力與其提取物在抗抑郁上的應用[15]，但目前，牛大力治療抑郁癥的作用機制未見有相關報道。因此，本研究通過網絡藥理學的研究方法預測了牛大力治療抑郁癥的潛在活性成分以及作用靶點。網絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學理論，通過選取特定信號節(jié)點來進行多成分、多靶點藥物分子設計的新學科，本研究旨在從牛大力中篩選出與治療抑郁癥相關的潛在活性成分，并預測這些成分的關鍵靶點及相關的信號通路，為牛大力治療抑郁癥機制的研究奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 牛大力活性成分的篩選與檢索 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP 2.3，http://tc‐mspw.com)以“牛大力”為關鍵詞進行檢索，篩選標準：口服生物利用度(OB) ≥30%和類藥性(DL) ≥0.18；同時查閱文獻，檢索和收集牛大力的活性成分信息，去除不明確的成分[16-19]。

1.2 牛大力活性成分靶點的預測 在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov,2020-08-15）數(shù)據(jù)庫中查找牛大力活性成分的SMILES 格式并保存，并將其導入Swiss Target Prediction（http://www.swis‐stargetprediction.ch,2020-08-17）數(shù)據(jù)庫以SMILES文件為模板進行靶點預測，選擇物種為大鼠，保存導出的結果并刪除可能性＜0 的靶點，得到最終的活性成分靶點。

1.3 抑郁癥相關靶點的預測和整理 利用Gene Cards 5.0（https://www.genecards.org/）對抑郁癥相關靶點進行檢索，在數(shù)據(jù)庫中以“depression”為關鍵詞檢索，收集score≥10 的靶點信息進而獲得最終的疾病相關靶點。

1.4 活性成分－靶點－疾病網絡的構建 利用韋恩圖篩選出成分－疾病共靶點，再將活性成分和疾病的共有靶點導入Cytoscape3.2.1 軟件中構建活性成分－靶點－疾病網絡結構圖。該網絡結構圖中節(jié)點表示靶點，節(jié)點連線越多，連接的度值(degree)越大，說明這個節(jié)點在其中的作用越重要，因此本研究通過度值、介度等指標進一步評價了牛大力中較為重要的成分與作用靶點。

1.5 靶蛋白互作網絡的構建 將共有靶點導入String（http://stitch.embl.de,2020-08-29）數(shù)據(jù)庫，限定物種為大鼠，將結果以tsv 格式導出，篩選結合率評分（combined score）≥0.7的作用靶點蛋白，并導入Cytoscape3.2.1 軟件構建PPI 圖，計算度(degree)、介度(betweenness)和緊密度(closeness)3 個拓撲學參數(shù)。

1.6 富集分析 按度、介度和緊密度≥其中位數(shù)的篩選標準[20]，將篩選得到的核心蛋白導入DAVID（https://david.ncifcrf.gov,2020-09-02）數(shù)據(jù)庫，選擇官方基因名，限定物種為大鼠，對牛大力作用靶點進行基因本體(GO)和KEGG 通路分析，以P＜0.05為選擇標準，從而分析牛大力主要涉及的KEGG 通路及生物過程。

1.7 分子對接 分子對接技術模擬小分子配體與受體大分子相互作用，并找到其最佳的結合模式。核心蛋白ID 從RCSB PDB（http://www.rcsb.org/,2020-09-15）數(shù)據(jù)庫中檢索下載，活性化合物的結構從PubChem 數(shù)據(jù)庫中獲得并轉化為mol2 格式。利用Surflex-Dock 工具進行分子對接，了解蛋白質與活性化合物的結合方式。

2 結果

2.1 活性成分的篩選 結合TCMSP 數(shù)據(jù)庫及文獻檢索共得到43 個牛大力活性成分，見表1，其中前10 個化學成分由TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選得到；后33 個化學成分由查閱文獻得到。

表1 牛大力活性成分

2.2 牛大力活性成分靶點的預測 SwissTargetPre‐diction 數(shù)據(jù)庫得到成分預測靶點250 個；GeneCards數(shù)據(jù)可得到抑郁癥預測靶點557個，見圖1A。

2.3 活性成分－靶點－疾病網絡的構建 經過韋恩圖篩選后得到53 個共有靶點，將共靶點導入Cy‐toscape3.2.1得到網絡結構圖，見圖1。圖1 B中共有98 個節(jié)點，其中有53 個靶點節(jié)點，43 個活性成分節(jié)點，1個牛大力節(jié)點，1個抑郁癥疾病節(jié)點，并構成了285條相互作用關系。

圖1 活性成分－靶點－疾病網絡

2.4 靶蛋白互作網絡的構建 將String數(shù)據(jù)庫結果進行篩選得到42 個作用靶點蛋白，并導入Cyto‐scape3.2.1 軟件得到蛋白互作圖，見圖2。該網絡共有42 個節(jié)點，構成164 個相互作用的線段，其中度值≥9.5，介度≥0.012 705 43，緊密度≥0.455 555 56的核心蛋白共有10個，提示牛大力治療抑郁癥的藥理作用可能通過以上靶點起治療作用。其拓撲性質見表2。

圖2 蛋白互作網絡圖

表2 牛大力治療抑郁癥的關鍵靶點及拓撲性質

2.5 富集分析 GO 分析生物過程(BP)，分子功能(MF)和細胞組分(CC)；經過篩選后富集到38 個BP（圖3 A），包括監(jiān)管行為(regulation of behavior)、多巴胺分泌調節(jié)(regulation of dopamine secretion)、隔絕鈣離子釋放到細胞質(release of sequestered calci‐um ion into cytosol)、對可卡因反應(response to co‐caine)、突觸傳遞負調控(negative regulation of syn‐aptic transmission)、谷氨酸(glutamatergic)等；8個MF(圖3 B)包括藥物綁定(drug binding)、5-羥色胺綁定(serotonin binding)、神經遞質受體的活動(neu‐rotransmitter receptor activity)、G-蛋白偶聯(lián)血清素受體活性(G-protein coupled serotonin receptor activi‐ty)、蛋白結合(protein binding)、Gi/Go 耦合多巴胺神經遞質受體活動(dopamine neurotransmitter receptor activity,coupled via Gi/Go)等；5個CC（圖3 C），包括原生質膜的組成部分(an integral component of plas‐ma membrane)、樹突(dendrite)、軸突(axon)等。

KEGG 通路富集到4 條通路，見圖3D，主要包括神經活動配體－受體相互作用通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)、含血清素的神經突觸(Serotonergic synapse)、CAMP 信號通路(cAMP sig‐naling pathway)、間隙連接(Gap junction)。

2.6 分子對接 將核心蛋白與其相對應的活性成分進行分子對接，對接結果見表3和圖4。成分與靶點的對接得分和氫鍵的數(shù)量是評價其結合能力的重要指標，對接得分＞5.0表明蛋白與成分有較好的結合能力，對接得分＞7.0表明蛋白與活性成分結合能力較強[21]。

圖3 富集分析圖

表3 活性成分與靶點蛋白分子對接得分表

圖4 活性成分與核心靶點對接示意圖

3 討論

本研究利用網絡藥理學的研究策略，對牛大力治療抑郁癥的主要成分、靶點和潛在的作用機制進行分析。由圖2 可知，牛大力中2,2-二甲基-3-(3,7,12,16,20-五甲基-3,7,11,15,19-二十一碳五烯基)-環(huán)氧乙烷化學成分連接節(jié)點最多，在分子對接中得分也較高，但目前并未有文獻報道其有治療抑郁癥的療效。而補骨脂二氫黃酮、甘草酸、甘草素等化學成分可能是治療抑郁癥的主要藥效成分，其中補骨脂二氫黃酮具抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、抗抑郁的藥理作用[22]；甘草酸，甘草素具有抗氧化、抗凋亡損傷，抗單胺氧化酶、調節(jié)單胺神經遞質等藥理作用，進而發(fā)揮治療抑郁癥的療效[23]。

通過蛋白互作網絡分析，篩選得到大麻素Cnr1、5-羥色胺1b 受體（Htr1b）、Htr1d、Drd3 等10 個核心靶點蛋白，這些蛋白共同參與調控抑郁癥的治療。Cnr1 可以影響抑郁癥的代謝，調節(jié)神經遞質的釋放而起到調節(jié)抑郁癥的作用[24-25]。Htr1b、Htr1d是5-羥色胺受體的其中2 種，5-羥色胺（5-HT）是一類重要的單胺類神經遞質，5-HT 受體可以調控HPA軸起到緩解抑郁癥的作用，而5-HT的前體物質是色氨酸(TRP)，TRP 是人體必需氨基酸之一，對中樞神經系統(tǒng)中的5-HT 在神經元和突觸可塑性發(fā)揮著重要的作用[26-27]。Drd3 是多巴胺受體的一個亞型，已有研究表明，D3受體可能與大腦認知和性感活動有關[28]。Song 等[29]對小鼠的研究可知，D3 缺失將導致細胞為DA 水平升高以及對可卡因的敏感性增強；Leggio 等[30]在進行強迫游泳實驗發(fā)現(xiàn)，D3 受體缺失小鼠對抗抑郁藥物的作用更為敏感，由此表明DA對抑郁癥的治療有一定的療效。

通過富集分析可得多巴胺分泌調節(jié)、對可卡因反應、突觸傳遞負調控、5-羥色胺綁定、神經遞質受體活動、Gi/Go 耦合多巴胺神經遞質受體活動、含血清素的神經突觸、CAMP 信號等相關通路，這些通路都與抑郁癥的治療機制相關聯(lián)。神經發(fā)生障礙是抑郁癥產生的關鍵病理機制。神經系統(tǒng)受體－配體通路、CAMP 信號通路與神經調節(jié)相關，在CAMP-PKA-CREB-BDNF 通路中，多種神經遞質與G 蛋白偶聯(lián)受體結合之后使CAMP 含量增高，從而調節(jié)轉錄因子活性介導細胞對外界的刺激[31]。

從分子對接結果可以看出，Cnr1 與金色酰胺醇酯有強烈的結合能力，金色酰胺醇酯具有抗炎作用[32]，可能通過抗炎作用發(fā)揮治療抑郁癥作用；Drd3與甘草酸有較好的結合能力，蛋白與分子之間結合有4 個氫鍵，甘草酸通過調節(jié)驗證水平因子發(fā)揮抗抑郁作用[33]。促性腺激素釋放Gnrhr 與甘草查爾酮A、補骨脂二氫黃酮結合能力較好，均有氫鍵結合，甘草查爾酮A、補骨脂二氫黃酮屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗抑郁作用[22]；App 與雙去氧基姜黃素、異槲皮素、槲皮素強烈結合，雙去氧基姜黃素屬于姜黃素類成分，姜黃素具有抗氧化、抗炎作用[34-35]，由此推測其可能通過抗氧化自由基和調節(jié)皮質類固醇的活性而發(fā)揮治療抑郁癥的作用，其中與異槲皮素有8個氫鍵結合，異槲皮素、槲皮素可能通過調節(jié)升高5-HT、多巴胺、去甲腎上腺素的濃度而產生抗抑郁作用，也可以調節(jié)下丘腦－垂體－腎上腺皮質(HPA) 軸的應激應答反應來發(fā)揮其治療抑郁癥的療效[36]。而亞麻酸乙酯、鄰苯二甲酸二辛酯雖對接得分較高，但目前未見有相關文獻報道其具有抗抑郁作用。

綜上所述，本次研究采用網絡藥學的方法對牛大力治療抑郁癥的作用機制進行分析。牛大力和抑郁癥預測到53 個共有靶點，經篩選得到大麻素Cnr1、Htr1b 等10 個關鍵靶點。這些核心蛋白經KEGG 通路富集，預測出牛大力可能是刺激神經組織，調節(jié)CAMP 信號通路、神經遞質受體活動而發(fā)揮抗抑郁癥作用，這體現(xiàn)了牛大力多成分、多靶點、多通路的特點。分子對接的結果也進一步說明了牛大力的主要活性成分與關鍵的靶點蛋白有很好的結合活性，為牛大力治療抑郁癥的研究提供了理論依據(jù)。本研究的不足之處在于網絡藥理學只是預測藥理作用的一種方法，雖然在中藥研究方面已經開始逐漸應用，但目前計算機結果還不能取代實驗數(shù)據(jù)，因此還需要動物實驗加以驗證。