莫小香，黎 驪，黃國林，宋錦靜，于 菲，韋彤彤，陽 潔Δ

（1.廣西醫(yī)科大學藥學院，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院藥學部，南寧 530022）

近10年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球所有類型癌癥中均位居第一[1-3]。非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）是我國肺癌的主要亞型，其中，85%的肺癌患者屬于腺癌[4]。與其他肺癌類型比較，NSCLC 癥狀隱匿，極易與其他肺部疾病混淆而漏診，從而導致患者錯失手術治療時機[5]。盡管NSCLC 治療方式多樣，但因其進展迅速，多數(shù)患者確診時已發(fā)生遠處轉移，難以采用手術治療且對可選擇的治療手段容易發(fā)生耐受，平均5 年生存率低，約為15%[3,6-7]。因此，遠處轉移仍是NSCLC 患者遠期生存率低的關鍵原因，目前抑制NSCLC 轉移的治療方式還十分有限[7-8]。

細胞遷移誘導透明質酸結合蛋白（cell migra‐tion inducing protein，CEMIP）是近年來被發(fā)現(xiàn)的一個具有透明質酸（hyaluronan，HA）水解酶活性，調節(jié)細胞運動的蛋白[9]。大量研究發(fā)現(xiàn)，CEMIP 異常高表達與結直腸癌、宮頸癌、肝癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉移呈正相關關系，而鮮少有報道CEMIP對肺癌的影響[10-12]。因此，本研究擬在細胞水平上干預CE‐MIP 的表達，并通過實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、Western blotting、Transwell等技術檢測細胞侵襲、遷移能力、上皮間質轉化（epi‐thelial-mesenchymal transition，EMT）標志物的表達變化及其細胞內信號通路的改變，探究CEMIP 對NSCLC侵襲、遷移的影響及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 NSCLC 細胞株A549、H1299 購自中科院上海研究所細胞庫，人正常肺細胞BEAS-2B 購自中科院昆明研究所細胞庫；RPMI-1640、胎牛血清購Thermo Fisher Scientific 公司；總RNA 提取試劑RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒（Prime‐Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser）、qPCR 擴增染料（TB Green?Premix Ex Taq?II）購自TAKA‐RA 公司；CEMIP 一抗（Proteintech 公司）、GAPDH（BBI公司）、E-cadherin（CST公司）、N-cadherin（Pro‐teintech公司）、Vimentin（CST公司）、Twist1（Protein‐tech公司）、Snail1（Proteintech公司）；STAT3（CST 公司）、Src（Proteintech公司）、p-AKT（CST公司）、AKT（abcam 公司）、Alex-555-羊抗兔（BBI 公司）、羊抗兔、羊抗鼠二抗購自CST公司；CEMIP干擾慢病毒、陰性對照干擾慢病毒購自上海吉凱公司。

1.2 臨床標本收集 收集2017 年8 月至2018 年8月廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院收治的6 例NSCLC患者（男4例、女2例，中位年齡66歲）經(jīng)手術切除的肺癌組織及其癌旁正常肺泡組織。病例納入標準：（1）年齡大于18 歲；（2）ESCO 得分＜2 分；（3）病理診斷證實為NSCLC 且具有完整的病歷；（4）術前未曾接受放、化療；（5）未合并其他重大疾病。

1.3 免疫熒光染色檢測病理組織CEMIP表達情況 將病理切片置于提前預熱的烤箱，72 ℃烤片5 h，經(jīng)過二甲苯－乙醇梯度脫蠟、復水，用檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液（pH=6）進行高壓抗原修復，高壓上汽5 min 后停止，待其降至室溫取出切片。修復后的切片用PBS 洗2 次，然后用5% BSA 室溫封閉1 h。按1∶100（CEMIP 抗體∶PBS）比例配置CEMIP一抗稀釋液，4 ℃冰箱孵育過夜，次日37 ℃復溫1 h，用PBS 洗2 次，加入熒光二抗：Alex555-羊抗兔（1∶100），37 ℃孵育1 h。PBS 洗滌后，加入DAPI 染核5 min，洗滌3 次后切片用甘油封片。在激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡公司，Model DMi8）下觀察并拍照，記錄CEMIP 染色情況，用Image J軟件進行半定量分析。

1.4 細胞培養(yǎng) NSCLC 細胞株A549、H1299 細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青－鏈霉素的RMPI-1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。肺正常細胞BEAS-2B 用含0.4%牛腦垂體提取物、0.1%氫化可的松、0.1%重組表皮生長因子、0.1%腎上腺素、0.1%胰島素、0.1%轉鐵蛋白、0.1%三碘甲狀腺素、0.1%視黃酸的BEBM 基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5 慢病毒轉染構建穩(wěn)定干擾CEMIP 細胞株 將對數(shù)生長期的細胞接種到24 孔板，每孔2×104個細胞，每孔加入500 μL RMPI-1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。第2 天，吸棄原細胞培養(yǎng)液，用PBS 洗2 次，然后每孔加入500 μL 稀釋后的病毒液，病毒滴度為5×106TU/mL，同時設置陰性對照組，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12～24 h 后，吸棄病毒液，用PBS 洗2 次，然后加入500 μL 新鮮RMPI-1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。觀察細胞狀態(tài)，必要時給予換液，如果細胞融合度達到80%～90%則將細胞消化轉移到25T 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。用熒光顯微鏡觀察細胞GFP 熒光的表達情況，細胞用3 μg/mL 嘌呤霉素持續(xù)篩選2 周后，可獲得穩(wěn)定轉染細胞株。通過qPCR 和Western blotting 驗證所轉染細胞株構建成功后，將細胞分為干擾組（shCE‐MIP 組）和轉染陰性對照病毒的陰性對照組（shNC組）。

1.6 qPCR 法檢測細胞CEMIP mRNA 表達 按照試劑說明書，提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，用實時定量PCR 儀（ABI 7500，美國）檢測CEMIP mRNA 表達水平。CEMIP 上游引物：5’-TCGGTC‐CAAGAGTCCATTC-3’，下游：5’-CTCCATCACCACTAATCTCCC-3’；GAPDH 上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸34 s，共40個循環(huán)；添加熔解曲線：95 ℃10 min，60 ℃15 s，95 ℃5 s。采用2－ΔΔct法計算mRNA相對表達量。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲、遷移能力 遷移實驗：將各組細胞預先用無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h。消化收集各組細胞，用無血清RMPI-1640 培養(yǎng)基重懸成5×105個/mL濃度，每孔100 μL分別接種到Transwell 上室，并在下室加入600 μL 含10% 胎牛血清的RMPI-1640 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，取出小室，用棉簽擦凈濾膜上未轉移的細胞，用4%多聚甲醛固定30 min、0.1% 的結晶紫染色30 min，洗凈風干，在倒置顯微鏡下觀察(200×)，取8 個視野拍照、計數(shù)，取均數(shù)。每組設3個復孔。細胞遷移能力用平均細胞數(shù)/高倍鏡視野表示。

侵襲實驗：將Matrigel 原液與無血清RMPI-1640 培養(yǎng)基按1:8 稀釋，在Transwell 小室上室加入100 μL 稀釋后的Matrigel 基質膠，置于37 ℃培養(yǎng)箱1 h。待上室中的膠凝固后取出小室，消化收集各組饑餓處理后的細胞，用無血清RMPI-1640 培養(yǎng)基重懸成8×105個/mL 濃度，每孔100 μL 分別接種到Transwell上室，并在下室加入600 μL含10%胎牛血清的RMPI-1640 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，取出小室。后續(xù)處理及統(tǒng)計與遷移實驗相同。

1.8 劃痕實驗測定細胞愈合能力 預先在6 孔板底部用記號筆每隔0.5～1.0 cm均勻畫橫線，然后在6孔板中加入各組細胞，每孔5×105個細胞，用完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。第2 天用10 μL 槍頭在孔板底部垂直于背后的橫線畫痕，PBS沖洗干凈后，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，移到10×光鏡下觀察各組細胞遷移情況，拍照記錄。然后放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)，必要時更換無血清培養(yǎng)基，并在48 h進行拍照記錄。愈合率%=（0 h寬度?48 h寬度）/0 h寬度×100%。

1.9 Western blotting法檢測細胞CEMIP、EMT標志蛋白及相關通路蛋白的表達 提取各組細胞蛋白，采用BCA 定量法測定各組細胞蛋白濃度；取30 μg的蛋白進行SDS-PAGE 分離蛋白，將蛋白轉移至NC 膜；5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h 后，分別加入一抗：CEMIP 抗體（1∶800）、GAPDH 抗體（1∶2 000）、Ecadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、Twist1（1∶500）、Snail1（1∶500）、STAT3（1∶500）、Src（1∶1 000）、p-AKT（1∶2 000）、AKT（1∶1 000），4 ℃冰箱孵育過夜；PBST 洗膜，分別加入二抗（1∶10 000或1∶30 000）室溫下孵育1 h，PBST洗膜，用雙色紅外成像系統(tǒng)（美國Licor 公司，ODYSSEY）掃膜，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CEMIP在NSCLC臨床標本中的表達 肺癌組織中CEMIP 的表達明顯高于其配對癌旁正常肺泡組織（P＜0.05），約為1.56倍，見圖1。

2.2 CEMIP 在肺癌細胞A549、H1299 及肺正常細胞BEAS-2B 的表達 肺癌細胞A549 和H1299 的CEMIP mRNA 及蛋白表達水平均顯著高于肺正常細胞BEAS-2B（均P＜0.05），見圖2。

2.3 干擾CEMIP后NSCLC細胞中CEMI mRNA及蛋白表達 經(jīng)嘌呤霉素穩(wěn)定篩選后，病毒的轉染效率均達90%以上。與shNC組比較，shCEMIP組CE‐MIP mRNA 及蛋白表達量均顯著降低（均P＜0.001），見圖3。

2.4 干擾CEMIP 表達對NSCLC 細胞侵襲、遷移能力的影響 H1299、A549 細胞中shCEMIP 組的遷移、侵襲細胞數(shù)均顯著少于其shNC 組（均P＜0.01），見圖4。

2.5 干擾CEMIP 表達對NSCLC 細胞愈合能力的影響 H1299、A549 細胞中，shCEMIP 組細胞愈合率均顯著低于shNC組（均P＜0.001），見圖5。

2.6 干擾CEMIP表達對NSCLC細胞EMT的影響 H1299 和A549 細胞shCEMIP 組的上皮標志物E-cadherin蛋白表達量顯著高于shNC組（P＜0.05），而間質標志物N-cadherin、Vimentin、Twist1、Snail1蛋白表達量均低于shNC組（均P＜0.05），見圖6。

2.7 干擾CEMIP 表達對NSCLC 細胞轉移相關信號通路蛋白的影響 干擾CEMIP 后，H1299 和A549 細胞Src、p-AKT、AKT、STAT3 表達均呈不同程度下降（P＜0.05），見圖7。

3 討論

圖1 CEMIP在NSCLC組織樣本中的表達

圖2 CEMIP在肺癌細胞A549、H1299及肺正常細胞BEAS-2B中的表達

圖3 干擾CEMIP后NSCLC細胞中CEMIP的mRNA及蛋白表達

圖4 干擾CEMIP表達對NSCLC細胞遷移、侵襲能力的影響

圖5 干擾CEMIP表達對NSCLC細胞劃痕愈合能力的影響

圖6 干擾CEMIP表達對NSCLC細胞EMT標志物蛋白表達水平的影響

圖7 干擾CEMIP表達對NSCLC細胞轉移相關信號通路蛋白表達的影響

大量研究表明，NSCLC 細胞在一些蛋白、轉錄因子的驅動下，通過EMT 而獲得強大的侵襲、轉移能力，發(fā)生遠處轉移。EMT 是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間充質細胞轉化的現(xiàn)象[13]。NSCLC 細胞發(fā)生EMT 時，表現(xiàn)為失去上皮細胞特性而獲得間質細胞特性，如極性消失、呈梭型改變；細胞間粘附減弱、運動能力增強；上皮細胞標記物如E-cadherin 表達下調；間質細胞標記物如N-cad‐herin、vimentin 等表達上調，轉錄因子Snail、Slug、Twist、ΔEF1/ZEB1、SIP1/ZEB2、E12/E47 等表達增加[13-14]。最近，Yu 等[15]采用免疫組化檢測14 對臨床標本中YAP1 的表達情況，發(fā)現(xiàn)其在具有顯著間質表型的NSCLC 癌組織中高表達；Yang 等[16]發(fā)現(xiàn)，高表達FOXP3 的NSCLC 能夠維持細胞的間質表型，并通過激活Wnt/β-catenin 使細胞具有更強的侵襲、轉移及增殖能力。Elumalai 等[17]通過敲除NSCLC細胞中PTEN 表達（PTEN-KO）發(fā)現(xiàn)，具有顯著間質表型的PTEN-KO 細胞表現(xiàn)出更強的侵襲、遷移能力，并在裸鼠模型上驗證PTEN-KO 細胞在體內更易發(fā)生遠處轉移。此外，Jakobsen 等[18]發(fā)現(xiàn)，對表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）耐藥的NSCLC 細胞具有很強的間質表型，且間質標記物的高表達與不良預后呈正相關。相反地，通過抑制EMT 則能夠減緩轉移的發(fā)生。由此可見，EMT表型轉化是NSCLC 細胞發(fā)生轉移的重要過程，EMT與NSCLC的預后、轉移有著密切聯(lián)系。

近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，CEMIP 通過調控多種腫瘤細胞EMT 表型轉化，驅動其發(fā)生遠處轉移。Xu 等[19]發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼耐藥的肝癌細胞出現(xiàn)明顯地間質化，這一現(xiàn)象與其中異常高表達的CEMIP協(xié)同EGF 誘導的EMT 轉化密切相關。該研究還在裸鼠肝癌耐藥模型中證實，高表達CEMIP的耐藥細胞更易發(fā)生遠處轉移。具體來說，由于CEMIP含有調控EMT 的高度保守的功能域，這使得其在多種腫瘤中均能促進EMT 進程[20]。此外，一篇CEMIP 與肺癌相關的研究報道，NSCLC 組織中CEMIP 表達水平比正常肺上皮組織明顯上調，CEMIP 在研究隊列中的強陽性率達49.67%，且高表達CEMIP 與腫瘤低分化、淋巴轉移、遠處轉移呈正相關關系[21]。本研究首先通過檢測收集的臨床標本，發(fā)現(xiàn)CEMIP 在NSCLC 癌組織中的表達顯著高于癌旁正常肺泡組織，體外細胞實驗采用qPCR 及Western blotting 同樣證實了CEMIP 在NSCLC 細胞A549、H1299 中的表達顯著高于肺正常細胞BEAS-2B（P＜0.05）。進一步通過干擾CEMIP 表達后發(fā)現(xiàn)，NSCLC 細胞的EMT 表型發(fā)生逆轉，表現(xiàn)為上皮標志物E-cadherin表達上調（P＜0.05），而間質標志物N-cadherin、Vi‐mentin、Twist1、Snail1 的表達下調（P＜0.05），表明CEMIP參與調控NSCLC細胞的EMT表型轉變。

研究表明，NSCLC 細胞發(fā)生EMT 表型的變化主要受細胞內PI3K/AKT、STAT3 信號通路的調控；抑制NSCLC 細胞中AKT[22]、STAT3[23]等信號通路，可逆轉細胞EMT 轉化，降低NSCLC 的侵襲遷移能力。Luo等[22]人報道，在NSCLC細胞中使用PI3K抑制劑后，可顯著下調其下游AKT、p-AKT 以及mTOR、p-mTOR 的表達，進而降低NSCLC 細胞的侵襲和遷移能力。p-AKT 能夠通過激活其下游mTOR 分子，或同時參與調控NSCLC 細胞EMT 轉化，從而促進其侵襲遷移[24]。而AKT 的激活依賴于蛋白激酶Src 與AKT 的SH2 功能域結合，使AKT 位于473 位的絲氨酸磷酸化。本研究檢測到干擾CE‐MIP 后可引起Src 表達量的降低，且p-AKT 也相應降低（P＜0.05），表明干擾CEMIP 能夠通過抑制Src表達，使其對信號蛋白AKT 的激活作用減弱。此外，還發(fā)現(xiàn)STAT3 也發(fā)生下調（P＜0.05），這可能與其上游p-AKT 表達降低有關，這一結果與Wei 等[25]發(fā)現(xiàn)抑制AKT/STAT3 能夠降低腎癌轉移的報道一致。

綜上所述，干擾CEMIP 表達可通過調控NSCLC 細胞中Src/AKT/STAT3 信號通路，抑制其EMT 過程，降低NSCLC 細胞侵襲、遷移能力。本研究提示CEMIP或可成為NSCLC 轉移治療的潛在靶點。