苑廣偉， 周潔嫦， 王欣宇， 崔 璨， 孫玉紅， 王 磊*

1.華南農(nóng)業(yè)大學材料與能源學院，廣州 510642；2.廣東唯新生物科技有限公司，惠州 516057；3.深圳唯新生物科技有限公司，深圳 518116

化石燃料的稀缺促使人們尋找其替代燃料和可再生能源，同時我國作為農(nóng)業(yè)大國，各種農(nóng)業(yè)廢棄物的處理成為一個難點[1,2]。富含碳水化合物的木質(zhì)纖維素類農(nóng)業(yè)廢棄物可用作可再生原料，目前的研究表明，可以通過物理化學降解和酶促降解進行發(fā)酵，用于生產(chǎn)單體糖[3]。

酶促降解農(nóng)業(yè)廢棄物時，至少需要三種類型的纖維素酶協(xié)同作用——內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.4，EG)、外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91，CBH)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21，BG)[4]。內(nèi)切葡聚糖酶(EG)破壞纖維素無定形結(jié)構(gòu)中存在的非共價相互作用，將長鏈纖維素分子分解成短鏈，生成大量小分子纖維素；外切葡聚糖酶(CBH)作用于多糖鏈末端，水解β-1,4-糖苷鍵，每次由非還原末端切下一個纖維二糖分子，故亦稱纖維二糖水解酶；β-葡萄糖苷酶(BG)將纖維二糖水解為葡萄糖[4,5]。羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase，CMCase)是一種內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，EG)，是降解纖維素過程中的主要纖維素酶，提高羧甲基纖維素酶活性成為研究的熱點[6]。

然而，纖維素酶的高成本和低生產(chǎn)率成為限制木質(zhì)纖維素材料酶促糖化的主要因素[7]。近些年的研究表明，許多微生物具有產(chǎn)生纖維素酶的能力，因此分離高產(chǎn)纖維素酶的微生物菌株、突變體，或通過分子克隆技術(shù)克隆編碼纖維素酶基因，提高纖維素酶基因表達量成為解決酶促糖化低生產(chǎn)率的解決方法[8]。利用微生物所產(chǎn)的纖維素酶對纖維素進行降解，是一種高效型、節(jié)約型、環(huán)境友好型的理想方式，已成為纖維素降解研究的熱點[9,10]。

橫梗霉菌(Lichtheimiaramosa)是毛霉目的一種絲狀真菌[11]，據(jù)報道，橫梗霉菌可以產(chǎn)生α-淀粉酶(α-amylase)[12]、β-葡糖苷酶(β-glucosidases, EC3.2.1.21，BG)[13,14]、木聚糖酶(xylanases)[15]、羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase，CMCase)[16]。本研究中，從土壤中分離得到一株橫梗霉菌XWNR1(LichtheimiaramosaXWNR1)，通過研究發(fā)現(xiàn)其具有產(chǎn)羧甲基纖維素酶的能力，初步優(yōu)化其產(chǎn)羧甲基纖維素酶的培養(yǎng)條件和酶學性質(zhì)，提高其產(chǎn)羧甲基纖維素酶的能力，為后續(xù)研究和生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源

橫梗霉菌XWNR1(LichtheimiaramosaXWNR1)，分離自廣東徐聞農(nóng)墾豐收農(nóng)場土壤。

1.1.2主要試劑和儀器

纖維素酶，銳陽生物；剛果紅、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，天津市福晨化學試劑廠；3,5-二硝基水楊酸，中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司；Tryptone，OXOID公司；Yeast extract，OXOID公司；酒石酸鉀鈉、重蒸苯酚、無水亞硫酸鈉、無水葡萄糖、NaH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、NaCl、CH3COONa，廣州化學試劑廠；瓊脂粉，廣州鼎國生物技術(shù)有限公司；E.Z.N.A.TMSP Fungal DNA Kit，OMEGA BIO-TEK；TaKaRa LA Taq?、10×Loading Buffer、 DL 2 000 bp DNA Marker、DL 15 000 bp DNA Marker，TaKaRa公司。高速冷凍離心機，SCILOGEX；磁力攪拌器，Kylin-Bell Lab Instruments；生物顯微鏡，奧林巴斯；血球計數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司；紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；pH計，奧豪斯儀器有限公司；超凈工作臺，蘇凈安泰；PCR儀，蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司；核酸測序儀，美國Applied Biosystems公司；電泳儀，美國Bio-rad公司；核酸成像系統(tǒng)，美國UVP公司。

1.1.3種子培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA，g/L)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，NaCl 3 g，KH2PO41.5 g，維生素B10.008 g，瓊脂粉15 g。

1.1.4發(fā)酵培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(Potato DextroseBroth，PDB，g/L)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，NaCl 3 g，KH2PO41.5 g，維生素B10.008 g。

1.1.5羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)篩選培養(yǎng)基(CMC-Na peptone agar，g/L)

CMC-Na 10 g，胰蛋白胨5 g，酵母粉0.5 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.2 g，NaCl 5 g，瓊脂粉12 g，pH 7.2～7.4。

1.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的分離、篩選

采用種子培養(yǎng)基進行土壤真菌的分離純化，取10 g土壤樣品，添加90 mL無菌水，置于恒溫搖床上28 ℃、180 r/min恒溫振蕩1 h，使土樣均勻地分散于無菌水中，制成10-1土壤懸液。采用稀釋涂布平板法和平板劃線法進行土壤真菌的分離純化。取10-1土壤懸液，通過梯度稀釋，使懸液稀釋至10-3；取100 μL不同稀釋梯度的懸液涂布于PDA固體培養(yǎng)基中，每個稀釋梯度做三個平行組；將涂布完畢的PDA平板置于生化培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d～4 d，觀察培養(yǎng)基上菌落生長情況，并通過平板劃線法根據(jù)菌落的形態(tài)特征挑取不同的單菌落進行劃線，從而獲得純化菌株。

采用剛果紅染色法[17,18]篩選具有產(chǎn)纖維素酶能力的菌株。具體方法如下：將已純化的絲狀真菌制備出孢子懸浮液；取孢子懸浮液以2%接種量、1×106CFU/mL接種濃度接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，獲得上清液，即粗酶液；上清液通過0.22 μm濾器進行處理，獲得無菌粗酶液；制備CMC-Na固體培養(yǎng)基平板，用打孔器在平板上打出間隔均勻的四個孔，標記其中一個為標準品M，作為陽性對照組(1 mg/mL纖維素酶標準品)，其他三個為同濃度無菌粗酶液，作平行實驗組。陽性對照點樣孔中加入20 μL無菌纖維素酶標準品溶液，平行實驗點樣孔中加入20 μL無菌粗酶液，置于生化恒溫箱中28 ℃反應(yīng)72 h；取出平板，加入 2 mL 2%的剛果紅溶液，混勻，靜置30 min后倒出，再加入3 mL 1 moL/L的NaCl溶液洗滌15 min倒出，最后用5%的CH3COONa固定處理10 min后倒出；拍照并記錄標準品與粗酶液在平板上產(chǎn)生的透明圈直徑大小，初步確定該菌是否具有纖維素酶活性。

1.3 菌株分子鑒定

采用E.Z.N.A.TMSP Fungal DNA Kit試劑盒法提取真菌基因組DNA。并以ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)[19]為引物進行PCR擴增，PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后，交由廣州擎科生物科技有限公司進行核酸測序(該公司采用Sanger測序，以磁珠為依托的半自動測序流程)。ITS序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，并基于條形碼ITS區(qū)段序列利用MEGA7.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹[20]。

1.4 粗酶液的制備

取不同培養(yǎng)條件下的橫梗霉菌發(fā)酵液，依次經(jīng)紗布過濾、12 000 r/min離心5 min、0.22 μm濾器過濾，獲得粗酶液，用于后續(xù)纖維素酶活性測定。

1.5 纖維素酶酶活力測定方法

采用DNS法[9]以CMC-Na為底物測定其羧甲基纖維素酶活力[21]。于5 mL離心管中加入2 mL羧甲基纖維素鈉溶液作為底物，然后加入0.5 mL制備的粗酶液，每個樣品做三個實驗平行組，同時另取一組不加粗酶液作為空白對照，振蕩均勻；將實驗組和空白對照組樣品均置于水浴鍋內(nèi)40 ℃恒溫反應(yīng)30 min；反應(yīng)完畢后，空白對照立即加入0.5 mL粗酶液，混勻；取實驗組反應(yīng)液0.5 mL，實驗組反應(yīng)液中加入1.5 mL DNS溶液，混勻，置于沸水中顯色10 min后，取出放入冰水中迅速冷卻終止反應(yīng)；取1.5 mL DNS溶液置于沸水中顯色10 min后，加入0.5 mL空白組反應(yīng)液，混勻，放入冰水中迅速冷卻終止反應(yīng)；通過紫外可見分光光度計測定吸光度值OD570 nm，得到吸光度值根據(jù)葡萄糖標準曲線得到對應(yīng)的還原糖濃度，從而計算出纖維素酶的酶活力。

葡萄糖標準曲線制備：配制濃度為：0 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL、0.7 mg/mL和0.9 mg/mL的葡萄糖溶液；分別取各濃度葡萄糖溶液0.5 mL，加入1.5 mL DNS溶液，置于沸水中顯色10 min后，取出放入冰水中迅速冷卻終止反應(yīng)；通過紫外可見分光光度計測定吸光度值OD570 nm；以葡萄糖的濃度為橫坐標，吸光度值OD570 nm為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，并獲得線性回歸方程(線性回歸系數(shù)應(yīng)在0.99以上)。

羧甲基纖維素鈉溶液制備[22]：準確稱取2 g羧甲基纖維素鈉于燒杯中，緩慢加入200 mL磷酸緩沖液(pH=6.7)，邊加熱邊攪拌至80 ℃～90 ℃，直至溶液澄清透明，加入磷酸緩沖液至接近300 mL，緩慢滴加2 mol/L的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0±0.05，容量瓶定容至300 mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNS溶液制備：6.3 g 3,5-二硝基水楊酸，21 g NaOH，182 g酒石酸鈉加入500 mL蒸餾水，加熱溶解后加入5 g重蒸酚和5 g亞硫酸鈉，冷卻后用蒸餾水定容至1 000 mL，存于棕色瓶中，放置7天后使用。

1個酶活力單位(U)的定義：在特定溫度、特定pH條件下，每分鐘內(nèi)催化底物羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1 μg還原糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

酶活力計算公式：U=W*N*1 000/(T*V)

注：U：纖維素酶酶活力；W：對照葡萄糖標準曲線得到的葡萄糖濃度；N：反應(yīng)體積(mL)；T：反應(yīng)時間(min)；1 000：mg-μg；V：粗酶液體積(mL)。

1.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

以培養(yǎng)時間、接種量兩個發(fā)酵條件優(yōu)化菌株產(chǎn)纖維素酶的能力。設(shè)置三個發(fā)酵培養(yǎng)重復組，以2×106接種濃度、2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，分別測定培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h時粗酶液的纖維素酶酶活。根據(jù)測定結(jié)果，選擇最優(yōu)培養(yǎng)時間，并在此培養(yǎng)時間條件下探索不同接種量(0.5%、1%、2%、4%和8%)對產(chǎn)酶的影響。最終確定適合產(chǎn)酶基本發(fā)酵條件。

1.7 pH、溫度對纖維素酶酶活的影響

在pH分別為3.0、5.0、7.0、9.0和10.0的纖維素酶反應(yīng)體系中，測定pH對纖維素酶活性的影響。根據(jù)測定結(jié)果，選擇最適pH；在最適pH的基礎(chǔ)上，設(shè)置不同的反應(yīng)溫度(4 ℃、20 ℃、40 ℃、60 ℃和80 ℃)，探索反應(yīng)溫度對纖維素酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

篩選出一株具有纖維素酶活性的絲狀真菌，命名為XWNR1。通過將該菌粗酶液接種至CMC-Na瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，接種粗酶液后CMC-Na瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈(圖1)，表明該菌的發(fā)酵液具有降解CMC-Na的能力，從而初步判斷該菌株具有產(chǎn)纖維素酶的能力。

注：實驗組1、2、3為加入XWNR1發(fā)酵液的三個平行實驗組，CK為加入1 mg/mL商品化纖維素酶的陽性對照組。

2.2 菌株XWNR1形態(tài)特征

菌株XWNR1在種子培養(yǎng)基上形態(tài)特征如圖2所示：菌落呈白色，質(zhì)地疏松，不透明，呈棉絮狀向上凸起。

圖2 XWNR1菌落形態(tài)

2.3 菌株XWNR1的分子鑒定

通過試劑盒法提取的該菌基因組DNA片段長度在15 000 bp以上，符合基因組DNA長度的大小，如圖3所示。通過ITS1/ITS4引物對進行PCR擴增，該菌PCR產(chǎn)物電泳條帶如圖4所示，其序列大小在750 bp～1 000 bp之間，符合ITS序列條帶大小相符。

注：M.15 000 bp marker；1.菌株XWNR1基因組DNA

注：M.2 000 bp maker，ITS為菌株XWNR1的PCR條帶

將ITS序列結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，該菌株與橫梗霉菌Lichtheimiaramosaisolate K12(MN190291.1)同源性最高，達到99%。故命名為：橫梗霉菌XWNR1(LichtheimiaramoseXWNR1)。進一步利用MEGA7.0軟件Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，如圖5所示，該菌株與Lichtheimiaramosaisolate K12(MN190291.1)聚為一支，進化距離最近。

圖5 XWNR1及同源菌株的ITS序列系統(tǒng)進化分析

2.4 菌株XWNR1產(chǎn)羧甲基纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1培養(yǎng)時間的優(yōu)化

由圖6可知，菌株XWNR1產(chǎn)羧甲基纖維素酶酶活力與培養(yǎng)時間存在一定關(guān)系。當培養(yǎng)60 h時，酶活力最高，達到36.4 U/mL；在培養(yǎng)時間小于60 h時，培養(yǎng)時間的增加，酶活力逐漸增加；當培養(yǎng)時間大于60 h時，酶活力反而降低，推測引起酶活力下降的原因是菌株發(fā)酵所需營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，菌株代謝物積累，導致菌株生長代謝受限；故培養(yǎng)時間60 h為產(chǎn)酶最適的培養(yǎng)時間。

注：CK：纖維素酶標準品，本研究所用纖維素酶溶液濃度為1 mg/mL。

2.4.2接種量的優(yōu)化

由圖7可知，以不同接種量進行培養(yǎng)菌株XWNR1時，其羧甲基纖維素酶活力有所變化。以1.0%和2.0%接種量進行液體培養(yǎng)時，羧甲基纖維素酶酶活力均達到36.0 U/mL；當接種量為0.5%時，酶活力下降；當接種量大于2.0%時，酶活力亦有所下降；通過接種量的優(yōu)化可知，1.0%和2.0%最適于桿菌產(chǎn)羧甲基纖維素酶，但考慮到節(jié)約的因素，故認為1.0%的接種量是該菌產(chǎn)羧甲基纖維素酶的最適接種量。

圖7 菌株接種量對羧甲基纖維素酶酶活力的影響

2.5 菌株XWNR1所產(chǎn)羧甲基纖維素酶酶學性質(zhì)分析

2.5.1pH對酶活的影響

由圖8可知，在pH=7.0時，羧甲基纖維素酶的酶活力最高，說明該酶屬于中性酶；pH高于或低于7.0時，酶活都有所下降；從pH適應(yīng)范圍來講，該酶的pH適應(yīng)范圍較寬，在偏酸、偏堿條件下，其酶活力仍保持較高水平，可見該酶具有良好的pH適應(yīng)范圍。

圖8 pH對羧甲基纖維素酶酶活力的影響

2.5.2反應(yīng)溫度對酶活的影響

本研究測定了五種溫度條件下該酶的活性，由圖9可知，該酶在40 ℃條件下反應(yīng)30 min時，酶活力最高，達到37.3 U/mL；60 ℃或20 ℃處理30 min時，酶活力仍然保持較高活力；80 ℃處理30 min時，酶活力下降至60%以下，可見該酶均有一定的耐高溫特性，但反應(yīng)溫度太高依然會降低其酶活力；4 ℃處理30 min酶活力下降至80%左右，可見該酶在低溫條件下亦保持較好的活性；綜上所述，該酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃且有較寬的溫度適宜范圍。

圖9 反應(yīng)溫度對羧甲基纖維素酶酶活力的影響

3 討論與結(jié)論

諸多絲狀真菌可以分泌大量纖維素酶并且能有效降解纖維素底物[23]，橫梗霉菌作為毛霉目的一種絲狀真菌，亦可以產(chǎn)生β-葡糖苷酶(β-glucosidases, EC3.2.1.21，BG)[13,14]、羧甲基纖維素酶(carboxymethylcellulase，CMCase)[16]等，但在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用橫梗霉菌生產(chǎn)纖維素酶的卻少見，究其原因，其所產(chǎn)纖維素酶的高效性、穩(wěn)定性還需進一步探索。本研究從土壤中分離出一株產(chǎn)羧甲基纖維素酶菌株，經(jīng)鑒定該菌株在分類學上與橫梗霉菌屬聚為一族，故命名為：橫梗霉菌XWNR1(LichtheimiaramosaXWNR1)，該菌株的保藏編號為CCTCC NO: M2018230。橫梗霉菌XWNR1以2.0×106接種濃度、1%接種量，28 ℃培養(yǎng)60 h時產(chǎn)生的羧甲基纖維素酶酶活力最高，可達到36.8 U/mL；該菌所產(chǎn)的羧甲基纖維素酶具有較寬的作用pH和溫度范圍，該酶在偏酸、偏堿條件下或高溫、低溫條件下都具有良好的酶活力，這反映出生產(chǎn)該酶的條件要求一般，適宜于工廠化大批量生產(chǎn)。

不同培養(yǎng)條件和酶活反應(yīng)條件對羧甲基纖維素酶酶活具有一定的影響。SILVA C等人使用Lichtheimiaramosa菌株以不同果蔬殘留物進行固態(tài)發(fā)酵，其羧甲基纖維素酶活達到最優(yōu)的培養(yǎng)時間因底物不同而有所不同，其以番石榴為底物時，30 ℃發(fā)酵120 h時或35 ℃發(fā)酵96 h時其酶活力最好[16]；GARCIA N F L等人的研究表明Lichtheimiaramosa菌株固體發(fā)酵時，35 ℃發(fā)酵96 h時其酶活力最好[2]；BALASUBRAMANIAN N等人通過對B.mycoidesS122C所產(chǎn)羧甲基纖維素酶酶學性質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)該酶在pH=7.0、反應(yīng)溫度50 ℃時酶活力最高，同時該酶在pH=5.0～10.0的范圍內(nèi)均具有較高的活性、在20 ℃至90 ℃的反應(yīng)溫度下均具有良好的活性，表明該酶具有較寬的作用pH和溫度范圍[9]；綜上所述，本研究獲得的橫梗霉菌XWNR1(LichtheimiaramosaXWNR1)所產(chǎn)羧甲基纖維素酶具有較寬的作用pH和溫度范圍，適宜于工業(yè)化應(yīng)用，為羧甲基纖維素酶工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定參考價值，后續(xù)將進一步研究羧甲基纖維素酶代謝調(diào)控機理。