王穎思， 周 剛， 彭 紅， 李素娟， 謝小保， 施慶珊

廣東省微生物研究所， 廣東省科學(xué)院， 華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510070

細(xì)菌生物膜是一種細(xì)菌聚集體，其構(gòu)成主要包括細(xì)菌菌體及其所分泌的胞外多聚物(EPS)，以及胞外蛋白、遺傳物質(zhì)(eDNA)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分子等，生物膜的形成過(guò)程可分成三個(gè)主要階段：(1) 附著，細(xì)菌達(dá)到附著表面并粘附其上；(2) 生長(zhǎng)成熟，粘附細(xì)菌開(kāi)始生長(zhǎng)，并分泌出胞外多糖等；(3) 脫離，細(xì)菌呈浮游狀態(tài)，可以在其它環(huán)境進(jìn)行粘附[1]。細(xì)菌生物膜的形成會(huì)引發(fā)一系列的環(huán)境和醫(yī)療問(wèn)題。淀粉樣纖維蛋白(Curli)是細(xì)菌生物膜的主要成分之一，其產(chǎn)生可增強(qiáng)細(xì)菌粘附、定植、侵襲的能力，導(dǎo)致致病力提高，該蛋白常在大腸桿菌和沙門(mén)氏菌中產(chǎn)生。Curli由七種亞基參與組裝形成，CsgA是Curli主要的結(jié)構(gòu)亞基，CsgA啟動(dòng)子的表達(dá)需要CsgD的協(xié)助，并且CsgA在膜內(nèi)形成可溶的蛋白后，CsgE抑制CsgA錯(cuò)誤折疊，通過(guò)CsgF-CsgG形成通道分泌到外膜，與CsgB結(jié)合形成不溶聚集的Curli[4-7]，但CsgA的分子功能以及對(duì)菌體的表型貢獻(xiàn)并不明朗。

魏氏檸檬酸桿菌(Citrobacterwerkmanii)BF-6是從工業(yè)腐敗物中分離得到的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)生物膜菌株，其生物膜粘附能力強(qiáng)，難以清除，從而引起許多工業(yè)產(chǎn)品如化妝品、洗滌劑等顏色、氣味變化，給工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的損失[3]，深入研究該菌的生物膜形成規(guī)律，將為以該菌為代表的霉腐細(xì)菌的防治提供理論指導(dǎo)。在本實(shí)驗(yàn)室前期的研究中發(fā)現(xiàn)BF-6生物膜中csgA基因與浮游菌相比，其表達(dá)量發(fā)生了上調(diào)[2]，但該基因發(fā)揮分子功能的具體方式未知。本文通過(guò)利用同源重組技術(shù)構(gòu)建csgA基因缺失株ΔcsgA，并進(jìn)行表型分析，研究Curli產(chǎn)生對(duì)BF-6生物膜的形成，以及對(duì)細(xì)菌耐藥性和Ca2+脅迫的效應(yīng)差異，并且與CsgA生物信息學(xué)分析相結(jié)合，從而揭示csgA基因在魏氏檸檬酸桿菌中的分子功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

魏氏檸檬酸桿菌(C.werkmaniiBF-6)是本實(shí)驗(yàn)室從工業(yè)腐敗產(chǎn)品中分離的高產(chǎn)生物膜菌株，儲(chǔ)藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為GDMCC 1.1242；大腸桿菌(EscherichiacoliS17-1)和pSRK質(zhì)粒由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)王海洪教授饋贈(zèng)；pYG4質(zhì)粒由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院叢延廣教授饋贈(zèng)。

1.1.2引物

實(shí)驗(yàn)所使用的引物見(jiàn)表1。

表1 csgA基因敲除和回補(bǔ)所使用的引物

1.2 方法

1.2.1CsgA的生物信息學(xué)分析

從NCBI網(wǎng)站下載魏氏檸檬酸桿菌CsgA的蛋白序列(No. WP_042309244.1)，用ProtParam在線軟件對(duì)該蛋白的基本特點(diǎn)進(jìn)行分析；用Dictyoglyc分析CsgA蛋白中的糖基化位點(diǎn)；并用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站SPOMA對(duì)CsgA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.2csgA的基因敲除和回補(bǔ)

以BF-6全基因組為模版，用引物csgA-up-F、csgA-up-R和csgA-down-F、csgA-down-R分別PCR擴(kuò)增csgA基因(No. B2G73_RS09265)上下游同源臂片段；并用BglII和NdeI雙酶切質(zhì)粒pYG4使其線性化；用In-fusion HD Clong Kit(Takara Bio USA, Inc)重組酶連接線性化pYG4質(zhì)粒、上游片段和下游片段，構(gòu)建敲除載體質(zhì)粒pYG4-Kana-csgA，并熱激轉(zhuǎn)化到E.coliS17-1感受態(tài)細(xì)胞中。敲除載體與BF-6接合轉(zhuǎn)移，涂布硫酸卡那霉素(100 mg/L)和利福平(20 mg/L)雙抗LB平板，篩選出一次交換菌株，將csgA基因一次交換菌涂布10%蔗糖平板進(jìn)行反向篩選，挑取單菌落用csgA-QJ-F/R引物PCR篩選和驗(yàn)證csgA敲除菌株。

以BF-6全基因組為模版，用csgA-com-F和csgA-com-R引物PCR擴(kuò)增csgA基因回補(bǔ)片段，用BamH I和NdeI雙酶切回補(bǔ)片段和pSRK質(zhì)粒，并用連接酶Ligation Kit(Takara)連接轉(zhuǎn)入E.coliS17-1感受態(tài)細(xì)胞中；將ΔcsgA和pSRK-GM-csgA接合轉(zhuǎn)移，涂布慶大霉素(30 mg/L)和利福平(20 mg/L)雙抗LB平板，篩選出csgA-com回補(bǔ)菌株，并用csgA-com-F/R進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將BF-6、ΔcsgA和csgA-com過(guò)夜培養(yǎng)菌液調(diào)成OD600=1.0，96孔板中每孔加入145 μL LB液體培養(yǎng)基，再加入15 μL稀釋好的菌液，采用Biotak生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀，在30 ℃靜置培養(yǎng)，每隔1h測(cè)試一次OD600吸光值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)菌生物膜實(shí)驗(yàn)

將BF-6、ΔcsgA和csgA-com過(guò)夜培養(yǎng)菌液調(diào)成OD600=1.0，LB培養(yǎng)液中加1%稀釋好的菌液，加入96孔板中，30 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；4 d后采用微孔板結(jié)晶紫染色法進(jìn)行染色，并用95%的乙醇脫色，最后用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀分別讀取細(xì)菌浮游菌吸光度(OD600)和脫色后生物膜吸光度(OD595)。

1.2.5細(xì)菌最小抑制濃度測(cè)定

用肉湯微量稀釋法測(cè)定6種抗菌藥物對(duì)野生菌和敲除菌的最小抑菌濃度(MIC)。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液濃度調(diào)為1×106CFU/mL，用2倍稀釋法稀釋抗菌藥(包括環(huán)丙沙星(CIP)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CIZ)、慶大霉素(GM)、羧芐青霉素(CB)、四環(huán)素(TE)、苯并異噻唑啉酮(BIT)、氯霉素(CL))，每孔加入100 μL MH培養(yǎng)液，首孔加入100 μL抗菌藥，混勻后吸取100 μL加入第二個(gè)孔，最后一個(gè)孔棄去100 μL培養(yǎng)液。再分別在每孔中加入10 μL菌液，30 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.6剛果紅平板實(shí)驗(yàn)

用無(wú)鹽LB培養(yǎng)基(Tryptone:10 g/L, Yeast extract:5 g/L, Agar:15 g/L)滅菌后加入剛果紅溶液，配置成40 mg/L剛果紅平板，將菌液調(diào)至OD600=1.0，取5 μL菌液滴加在平板表面，30 ℃培養(yǎng)2 d。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7剛果紅吸附定量分析

參照Beatable Sobieszczańska的方法[8]，并進(jìn)行一些改進(jìn)。過(guò)夜培養(yǎng)的BF-6、ΔcsgA和csgA-com接種于液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2 d后，將菌液濃度調(diào)成2×109CFU/mL，離心機(jī)12 000 r/min離心5 min，去上清液后，加0.01%剛果紅溶液重懸菌體，室溫孵育90 min，然后12 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)OD500。

1.2.8Ca2+脅迫條件下的生物膜形成量測(cè)定

將CaCl2加入LB培養(yǎng)基中配置成濃度為0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L、600 mmol/L和800 mmol/L溶液，并加入1%菌液，然后，分別加入96孔板中，30 ℃靜置培養(yǎng)4 d，采用微孔板結(jié)晶紫染色法進(jìn)行染色，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀分別讀取細(xì)菌浮游菌吸光度(OD600)和脫色后生物膜吸光度(OD595)，并以未外源添加任何CaCl2的培養(yǎng)基作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 CsgA生物信息學(xué)分析

用ProtParam對(duì)蛋白質(zhì)基本特點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CsgA具有149個(gè)氨基酸，化學(xué)分子式為C656H1032N204O218S2，原子總數(shù)為2112，估計(jì)半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為11.23，判定為穩(wěn)定蛋白質(zhì)；用Dictyoglyc分析發(fā)現(xiàn)在13、17、19和21位置，CsgA蛋白中存在糖基化位點(diǎn)；用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站SPOMA對(duì)CsgA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見(jiàn)圖1，表明：該蛋白多數(shù)為無(wú)規(guī)則卷曲，占53.6%，而β-折疊含26.85%，α-螺旋含有17.45%[9]，與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)CsgA具有高度保守的β-折疊序列，Ser X5Gln X1Gly X1Gly Asn X1Ala X3Gln形成β-折疊-環(huán)-β-折疊的結(jié)構(gòu)，在大腸桿菌中有5個(gè)重復(fù)的保守結(jié)構(gòu)，而在BF-6中的CsgA蛋白序列中只有三個(gè)重復(fù)的β-折疊-環(huán)-β-折疊結(jié)構(gòu)生成淀粉樣折疊[4，10]。

h: α-螺旋；t: β-轉(zhuǎn)角；c: 無(wú)規(guī)則卷曲；e: β-折疊

2.2 csgA的基因敲除和回補(bǔ)

以BF-6野生菌(WT)和ΔcsgA為模版，用引物csgA-QJ-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，野生菌擴(kuò)增出大條帶：1295 bp，ΔcsgA為小條帶：845 bp；回補(bǔ)菌株用csgA-com-F/R進(jìn)行擴(kuò)增得到450 bp條帶(圖2)；并且將上述條帶送往廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示所擴(kuò)增的條帶就是目的條帶，進(jìn)一步證實(shí)敲除菌株和回補(bǔ)菌株的構(gòu)建成功。

圖2 csgA基因敲除和回補(bǔ)菌株鑒定

2.3 csgA的敲除導(dǎo)致菌株形成生物膜的能力降低

將BF-6、ΔcsgA和csgA-com在96孔板中30 ℃分別培養(yǎng)48 h，每小時(shí)測(cè)量其菌液濃度OD600的變化，發(fā)現(xiàn)csgA敲除后和BF-6野生菌以及回補(bǔ)菌株生長(zhǎng)曲線相比，并沒(méi)有明顯差異(圖3)，說(shuō)明csgA基因的表達(dá)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響；而Curli的形成影響細(xì)菌的粘附性，影響細(xì)菌生物膜的形成，csgA敲除后魏氏檸檬酸桿菌的生物膜形成量明顯減少，但對(duì)浮游菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響(圖4)。

圖3 BF-6、ΔcsgA和csgA-com生長(zhǎng)曲線

圖4 BF-6、ΔcsgA和csgA-com浮游菌和生物膜形成

2.4 csgA的敲除改變菌體淀粉樣蛋白和纖維素的合成

細(xì)菌在30 ℃無(wú)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)后結(jié)合剛果紅呈現(xiàn)四種形態(tài)：rdar(red，dry and rough)產(chǎn)生Curli和Cellulose；pdar(pink dry and rough)只產(chǎn)生Cellulose，bdar(brown, dry, and rough)只產(chǎn)生Curli；saw(smooth and white)Curli和Cellulose均不產(chǎn)生[5,11]。野生菌BF-6菌落呈紅色干燥有褶皺，而敲除后細(xì)菌呈白色光滑，回補(bǔ)后細(xì)菌呈粉紅色光滑(圖5)，說(shuō)明野生菌產(chǎn)生Curli和Cellulose，敲除菌Curli和Cellulose均不產(chǎn)生，回補(bǔ)菌只產(chǎn)生Cellulose不產(chǎn)生Curli。上述結(jié)果表明csgA敲除后細(xì)菌Curli和Cellulose無(wú)法合成，導(dǎo)致對(duì)剛果紅結(jié)合能力明顯降低，褶皺消失。

A：BF-6野生菌，B：ΔcsgA敲除菌，C：csgA-com

野生菌BF-6和csgA-com在30 ℃中孵育1 h 30 min后，分別吸附了80.44%和74.26%的剛果紅，而ΔcsgA菌株只吸附了35.01%(圖6)，上述結(jié)果與csgA基因的缺失導(dǎo)致Curli不能合成相關(guān)，也和剛果紅平板實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

圖6 BF-6、ΔcsgA和csgA-com結(jié)合剛果紅定量測(cè)定

2.5 csgA的敲除改變菌體對(duì)部分殺菌劑的敏感性

選取了8種常見(jiàn)抗生素環(huán)丙沙星(CIP)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CIZ)、慶大霉素(GM)、羧芐青霉素(CB)、四環(huán)素(TE)、苯丙異噻唑啉酮(BIT)、氯霉素(CL)，測(cè)試BF-6、ΔcsgA和csgA-com對(duì)抗生素的MIC。結(jié)果發(fā)現(xiàn)csgA敲除后對(duì)慶大霉素(GM)、羧芐青霉素(CB)、頭孢噻肟(CIZ)的耐藥性升高，其余抗生素影響變化不明顯(表2)。青霉素類抗生素和頭孢噻肟抗生素主要抑制細(xì)胞壁的合成，而氨基糖苷類慶大霉素則是通過(guò)作用于細(xì)菌體內(nèi)的核糖體，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，破壞細(xì)胞膜通透性，最后細(xì)菌死亡。csgA基因缺失可能導(dǎo)致抗生素的作用位點(diǎn)缺失，從而導(dǎo)致耐藥性的提高。

表2 各種殺菌劑對(duì)BF-6、ΔcsgA和csgA-com的最小抑菌濃度

2.6 鈣離子對(duì)敲除菌浮游菌和生物膜形成影響

不同濃度Ca2+添加到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)野生菌、ΔcsgA和csgA-com，結(jié)晶紫染色后發(fā)現(xiàn)添加了Ca2+各菌株的生物膜形成量增加。但在低濃度Ca2+作用下，ΔcsgA生物膜形成隨Ca2+濃度變化幅度比BF-6野生菌和csgA-com??；當(dāng)Ca2+添加量達(dá)到400 mM時(shí)，生物膜形成量達(dá)到最大，再加大Ca2+濃度，生物膜形成量反而隨Ca2+濃度的增加而減少(圖7)，可能是由于Ca2+濃度過(guò)高導(dǎo)致滲透壓過(guò)高，從而導(dǎo)致細(xì)菌破裂死亡和生物膜的形成量降低。

圖7 鈣離子脅迫條件下BF-6、ΔcsgA和csgA-com的生物膜形成量

3 討論

細(xì)菌生物膜是由細(xì)菌體外分泌的多糖、eDNA、RNA等物質(zhì)所組成，其形成過(guò)程首先要完成對(duì)生物或者非生物表面的粘附，Curli參與表面粘附、細(xì)胞聚集和生物膜形成等過(guò)程，而CsgA作為淀粉樣蛋白Curli主要構(gòu)成亞基在其中也起到重要的作用。由二級(jí)結(jié)構(gòu)可以推測(cè)CsgA是β-折疊-環(huán)-β-折疊堆疊形成的立體結(jié)構(gòu)，最終形成盤(pán)繞絲狀結(jié)構(gòu)向外延伸[12]。報(bào)道發(fā)現(xiàn)CsgA帶極性的氨基酸(賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺)容易與二氧化硅吸附，而芳香族R基氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)則與石墨烯強(qiáng)烈吸附[13]。鼠傷寒沙門(mén)氏菌敲除csgA基因后，對(duì)Hela細(xì)胞的粘附侵入能力降低[24]。Curli的成型表達(dá)可以增加O157：H7的毒力[7]。本研究發(fā)現(xiàn)魏氏檸檬酸桿菌csgA基因缺失導(dǎo)致細(xì)菌Curli無(wú)法形成，從而導(dǎo)致生物膜形成能力下降。

Ca2+通過(guò)以下幾種方式增強(qiáng)細(xì)菌生物膜的形成：(1) 作為交聯(lián)橋分子，增強(qiáng)細(xì)胞生物膜基質(zhì)的穩(wěn)定性；(2) 可以調(diào)節(jié)生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)；(3) 通過(guò)與EF-handmotif(在1、3、5、7、12位置的殘基提供螯合Ca2+的配體)相結(jié)合，與氨基酸中陰離子相結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞間粘附等，影響蛋白質(zhì)構(gòu)象變化從而影響生物膜點(diǎn)形成能力，促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成[14-15,20-21]。低濃度Ca2+可以誘導(dǎo)Curli基因的表達(dá)，從而促進(jìn)生物膜的產(chǎn)生，而高濃度Ca2+可能與細(xì)菌產(chǎn)生沉積效應(yīng)。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)CsgA沒(méi)有與EF-handprotein相似的序列，從而無(wú)法與Ca2+相結(jié)合產(chǎn)生沉積。但在序列中有8個(gè)帶負(fù)電的氨基酸殘基，殘基可與Ca2+相結(jié)合，促進(jìn)細(xì)菌生物膜形成。因此Ca2+脅迫條件下缺乏csgA基因生物膜的形成量小于相同條件下的BF-6野生菌和回補(bǔ)菌形成量。

另外，在陰溝腸桿菌感染病例中分離的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，csgA和csgD大量的表達(dá)，說(shuō)明csgA是腸桿菌毒力相關(guān)基因[16-18]。加入不同濃度氨基糖苷類抗生素的細(xì)菌中，csgA的表達(dá)水平發(fā)生變化，說(shuō)明csgA與細(xì)菌耐藥性有關(guān)[23]，csgA的表達(dá)引起腸桿菌耐藥性增強(qiáng)，但本研究中發(fā)現(xiàn)BF-6中csgA敲除后生物膜形成減少，但對(duì)頭孢噻肟、慶大霉素和羧芐青霉素的耐藥增強(qiáng)，說(shuō)明三種抗生素耐藥性的產(chǎn)生與生物膜形成并不相關(guān)。與此同時(shí)，革蘭氏陰性菌還可以通過(guò)外膜低滲透壓以及孔蛋白的低表達(dá)而對(duì)青霉素和其它親水抗生素具有抗性[19]，csgA的缺失會(huì)導(dǎo)致脂蛋白Lpp的表達(dá)升高[22]，而Lpp缺失使大腸桿菌對(duì)萬(wàn)古霉素和利福平敏感[25]，可能CsgA表達(dá)引起了外膜的變化，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，具體作用機(jī)理還需要進(jìn)一步驗(yàn)證和探究。

本文通過(guò)對(duì)魏氏檸檬酸桿菌CsgA編碼基因進(jìn)行敲除，通過(guò)生物信息學(xué)與生長(zhǎng)曲線、生物膜、curli產(chǎn)生量、最小抑菌濃度和添加Ca2+對(duì)生物膜影響等表型相結(jié)合，對(duì)CsgA進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)CsgA與curli內(nèi)在的關(guān)系，為以后對(duì)清除生物膜的研究提供了理論的基礎(chǔ)。