馬小靜，李夢瑩，張淮瑜，宋阿北，許立華，吳心華，張巧娥，李繼東

(寧夏大學 農學院，銀川 750021)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea，BVD)和牛傳染性鼻氣管炎(infectious bovine rhinotracheities，IBR)是危害牛等反芻動物的兩類重要疫病，病原分別為牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)和牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus，IBRV)。BVDV和IBRV常混合感染牛群，引起多種臨床癥狀，對奶牛及肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了很大危害[1-3]。目前臨床尚無有效治療藥物，國內早期通常采用接種豬瘟兔化弱毒疫苗來預防BVD的發(fā)生[4]。2016年，商品化的BVD疫苗出現(xiàn)，為BVD-IBR二聯(lián)滅活苗，這也填補了國內IBR疫苗的空白[5]。傳統(tǒng)疫苗的出現(xiàn)有效地降低了BVD和IBR的發(fā)病率和防治成本，但同時也帶來一些無法避免的問題。滅活疫苗的優(yōu)點在于安全性較高[6]，但他們通常誘導較弱的中和抗體反應和較短的保護期[7]。相較于滅活苗，弱毒疫苗雖然能產生較強的免疫力且免疫保護周期較長[8]，但其存在較大的安全隱患，可能會引起流產、胎兒感染等不良反應[9]。為了探究更具前瞻性的防治措施，具有免疫反應持續(xù)時間長、安全性高、容易改造、儲存運輸方便等優(yōu)點的核酸疫苗[10-12]成為了當下的研究熱點。雖然也有學者擔心重組質粒有可能整合到宿主基因組，但迄今為止還沒有試驗數(shù)據(jù)來證實這種危險性[13]。

目前，國內外已經發(fā)表了較多針對BVD或IBR的核酸疫苗的研究，普遍利用其優(yōu)勢抗原基因作為核酸疫苗的靶基因且得到了較好的研究成果。國內石明[14]對作為核酸疫苗靶基因的BVDV囊膜蛋白E0和E2的疫苗免疫效果進行了綜合評價，結果顯示可分別誘導較好的體液免疫和細胞免疫。國外Deshpande等[15]發(fā)現(xiàn)利用攜帶IBRVgD基因的質粒表達gD蛋白，能誘導小鼠產生抵抗IBRV的細胞毒性T細胞，為機體提供保護力；除gD外，以gC和gE為靶基因的核酸疫苗也得到研究，國內張帆等[16-17]先后構建IBRVgC、IBRVgE真核表達載體，并對其反應原性進行了研究。但是，對能夠同時防制BVD和IBR的二聯(lián)核酸疫苗的研究卻未見報道。因此，本試驗計劃擴增BVDVE0和IBRVgD目的基因，將兩者插入pVAX1-IRES中，構建pVAX1-E0-IRES-gD重組質粒，轉染293T細胞，利用間接免疫熒光試驗檢測E0和gD在293T細胞中的表達情況。此外，將pVAX1-E0-IRES-gD肌內注射免疫小鼠，研究其免疫效應。通過上述試驗過程及結果，為BVD-IBR二聯(lián)核酸疫苗的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒株、質粒、細胞和實驗動物

BVDV NADL病毒株、IBRV HVRI-002病毒株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；pVAX1質粒、MDBK細胞、BVDV和IBRV牛源陽性血清均由寧夏大學農學院預防獸醫(yī)學實驗室保存；大腸桿菌DH5α購自索萊寶生物科技有限公司；293T細胞株由寧夏大學農學院動物遺傳育種實驗室饋贈；18～22日齡SPF級小鼠，購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心；BVD-IBR二聯(lián)滅活苗(商品名：哞樂優(yōu))購自金宇保靈有限公司。

1.2 主要試劑及試劑盒

PBST、BSA、TMB顯色液、PEG6000(索萊寶)；限制性內切酶(NEB)；PrimeSTAR HS DNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶、DNA T4連接酶(TaKaRa)；兔抗牛IgG-FITC熒光二抗、HRP標記的兔抗鼠IgG(Abcam)；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、快速質粒小提試劑盒、無內毒素質粒大提試劑盒(Tigen)；Lipofectamine 3000轉染試劑盒(Thermo Fisher)；小鼠γ干擾素(IFN-γ)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、小鼠白細胞介素4(IL-4)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Elabscience)。

1.3 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank中的參考序列，利用Prime premier設計用于擴增BVDVE0、IBRVgD基因和IRES元件的引物(表1)。在擴增BVDVE0基因和IBRVgD基因的5′端均引入了Kozak序列，這段序列的加入有助于后期重組質粒的表達等試驗順利進行。E0基因預期擴增大小為706 bp，包括684 bp的基因編碼區(qū)和酶切位點及Kozak序列；gD基因預期擴增大小為1 275 bp，包括1 254 bp的基因編碼區(qū)和酶切位點及Kozak序列。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 試驗所用引物序列Table 1 Primers sequences

1.4 目的基因的克隆

取出-80 ℃保存的BVDV和IBRV細胞培養(yǎng)物，反復凍融3次，利用DNA/RNA提取試劑盒提取病毒基因組。以獲得的IBRV DNA溶液為模板，對gD基因進行擴增，PCR反應體系：5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10 μL，dNTP Mixture 4 μL， 上下游引物各0.2 μL，基因組1.5 μL，ddH2O 34.1 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s；55 ℃退火15 s；72 ℃延伸2 min；35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以獲得的BVDV RNA溶液為模板，按反轉錄試劑盒操作步驟合成cDNA。對E0基因進行擴增，PCR反應體系：10×Buffer (Mg2+Plus) 5 μL，dNTP 4 μL，rTaq酶0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 3 μL，RNase free水36.5 μL。 PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應后進行2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V 30 min，用凝膠成像儀觀察結果并拍照。利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的基因E0和gD。

1.5 真核表達載體的構建

1.5.1 pVAX1-IRES載體的構建與鑒定 將本實驗室保存的pIRES-AcGFP1質粒作為模板，擴增IRES序列。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；98 ℃ 變性10 s；60 ℃退火15 s；72 ℃延伸1 min；35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應體系：5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，上下游引物各0.2 μL，pIRES-AcGFP1質粒1 μL，ddH2O 34.6 μL，合計50 μL。PCR反應后進行2%瓊脂糖凝膠電泳，110 V 30 min，用凝膠成像儀觀察結果并拍照。利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化IRES片段，利用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切pVAX1和IRES后，進行連接與轉化。產物經雙酶切鑒定并送至上海生工生物工程公司測序。

1.5.2 pVAX1-E0-IRES-gD重組質粒的構建與鑒定 用AfIⅡ、BamHⅠ同時雙酶切pVAX1-IRES和E0基因后，進行連接和轉化。產物經雙酶切鑒定，鑒定陽性者送往上海生工生物工程公司測序，得到重組質粒pVAX1-E0-IRES。將pVAX1-E0-IRES和gD基因均使用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切后，進行連接和轉化。產物經雙酶切鑒定，鑒定陽性者送往上海生工生物工程公司測序，得到重組質粒pVAX1-E0-IRES-gD。

1.6 間接免疫熒光法檢測目的基因的表達

依照天根無內毒素質粒大提試劑盒操作步驟提取空載體pVAX1-IRES和重組質粒pVAX1-E0-IRES-gD，調整兩者質量濃度為1.0 μg·μL-1。復蘇293T細胞并將其接種至六孔板中培養(yǎng)至細胞貼壁75%～85%。將構建好的重組質粒pVAX1-E0-IRES-gD和空載體pVAX1-IRES按照Lipofectamine 3000試劑說明書分別轉染293T細胞，另設空白對照。轉染48 h后，利用一抗(BVDV、IBRV陽性血清)和二抗(兔抗牛IgG-FITC)進行間接免疫熒光試驗(IFA)，檢測E0和gD基因在293T細胞中的轉錄和表達情況。

1.7 小鼠免疫試驗

1.7.1 動物免疫試驗設計 將108只SPF級小鼠分為6個試驗組，Ⅰ～Ⅲ組為重組質粒pVAX1-E0-IRES-gD注射組，質粒注射量分別為 50、100和200 μg·只-1；Ⅳ組為空載體pVAX1-IRES注射組(100 μg·只-1)；Ⅴ組為PBS對照組(0.2 mL)；Ⅵ組為BVD-IBR滅活苗注射組(0.2 mL)。免疫方式均為小鼠腿部肌內注射，初次免疫2周后加強免疫1次。各組小鼠分別于首免前0 d，首免后7、14、21、28、42 d進行頜下靜脈采血，收集血清保存于-20 ℃ 備用；在0、14、28、42 d 4個時間點每組隨機選取2只小鼠，頸椎脫臼法處死后無菌采取脾，用于隨后的脾淋巴細胞增殖試驗。所有動物試驗均嚴格按照國家研究委員會實驗動物護理和使用指南的要求進行，并已提交寧夏大學實驗動物倫理與福利委員會批準(批準號：NXU-ACAU-2019-010)。

1.7.2 免疫小鼠血清中gD和E0抗體水平檢測 采用ELISA方法分別檢測兩次免疫后的小鼠血清中gD和E0特異性抗體水平的變化。對BVDV和IBRV進行增殖，將病毒培養(yǎng)液反復凍融3次，利用PEG6000進行病毒的純化。將純化好的病毒按照1∶100 的比例包被酶標板，4 ℃過夜。PBST洗板3次， 用含1% BSA的PBST作為封閉液，37 ℃作用2 h，洗去封閉液。加入1∶200倍稀釋的待檢血清，37 ℃作用1 h后洗板5次。加入HRP標記的兔抗鼠IgG酶標二抗(1∶8 000)，37 ℃作用1 h。最后依次加入TMB顯色液和終止液(2 mol·L-1硫酸)。用酶標儀檢測450 nm波長處各孔OD值。

1.7.3 免疫小鼠脾淋巴細胞增殖試驗 采用噻唑藍比色法(MTT)檢測免疫小鼠脾淋巴細胞增殖情況。無菌采取小鼠脾進行淋巴細胞分離并制備脾淋巴細胞懸液，用1640完全培養(yǎng)液調整懸液中細胞數(shù)至1×106個·mL-1。按每孔100 μL依次加入96孔板中，每個樣品做3個重復。加入終質量濃度為10 μg·mL-1的ConA溶液，輕輕混勻后置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在結束培養(yǎng)前4 h取出細胞培養(yǎng)板，輕輕吸出上清液后加入5 mg·mL-1的MTT溶液10 μL·孔-1，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入100 μL DMSO以終止反應。震蕩15 min后測定各孔OD490 nm值。

1.7.4 免疫小鼠血清中細胞因子IFN-γ和IL-4檢測 參照小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒和小鼠IL-4酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書，檢測小鼠首免后42 d采集的血清中細胞因子IFN-γ和IL-4的含量。

1.7.5 免疫小鼠血清中的中和抗體檢測 依照微量血清中和試驗(固定病毒-稀釋血清法)對免疫小鼠血清中的中和抗體水平進行檢測。將首免后42 d的小鼠血清60 ℃滅活30 min，自1∶2開始進行2倍稀釋。稀釋好的血清分別與200 TCID50的BVDV NADL病毒株、IBRV HVRI-002病毒株等體積混合于96孔細胞培養(yǎng)板，置于37 ℃溫箱中孵育1 h，每孔加入定量MDBK細胞懸液。同時設病毒回歸試驗作為參考。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，逐日觀察細胞病變情況。采用Reed-Muench兩氏法計算被檢血清的中和抗體效價。

1.7.6 數(shù)據(jù)處理 使用EXCEL軟件對數(shù)據(jù)進行整理；利用SPSS 20.0對各組內數(shù)據(jù)進行單因素方差分析；采用GraphPad Prism 8.0作圖。

2 結 果

2.1 目的基因的擴增

以提取的BVDV cDNA溶液和IBRV DNA溶液為模板分別擴增E0和gD基因。取PCR產物各0.5 μL，進行2%的瓊脂糖凝膠電泳(圖1)。電泳圖顯示E0片段約為706 bp，gD片段約為1 275 bp， 與預期大小相符。

M. DNA相對分子質量標準(2000)；1. BVDV陰性對照；2. BVDV NADL株；3. IBRV HVRI-002株；4. IBRV陰性對照M. DNA marker (2000); 1. BVDV negative control; 2. BVDV NADL strain; 3. IBRV HVRI-002 strain; 4. IBRV negative control圖1 BVDV E0基因(A)、IBRV gD基因(B)的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of BVDV E0 (A), IBRV gD (B)

2.2 重組質粒的鑒定

對構建好的重組質粒進行雙酶切鑒定(圖2)，雙酶切鑒定陽性者送上海生工測序。結果顯示，pVAX1-E0-IRES重組質粒中包含E0基因編碼區(qū)684 bp，AfIⅡ和BamHⅠ酶切位點及Kozak序列均得到正確引入，說明E0序列正確插入pVAX1-IRES中IRES序列的上游區(qū)域；pVAX1-E0-IRES-gD中包含gD基因編碼區(qū)1 254 bp，EcoRⅠ和PstⅠ酶切位點和Kozak序列均得到正確引入，說明gD序列正確插入pVAX1-E0-IRES中IRES片段的下游區(qū)域，成功構建pVAX1-E0-IRES-gD真核表達載體。

M. DNA相對分子質量標準(8000)；A圖中1、2、3分別為BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切pVAX1-IRES、pVAX1、IRES的PCR產物；B圖中1、2、3分別為AfIⅡ和BamHⅠ雙酶切pVAX1-E0-IRES、pVAX1-IRES、E0的PCR產物；C圖中1、2、3分別為EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切pVAX1-E0-IRES-gD、pVAX1-E0-IRES、gD 的PCR產物M. DNA marker (2000); in Fig.A, 1, 2, 3 represent enzyme digestion of pVAX1-IRES, pVAX1, IRES by BamHⅠand EcoRⅠ, respectively; in Fig.B, 1, 2, 3 represent enzyme digestion of pVAX1-E0-IRES, pVAX1-IRES, E0 by AfIⅡand BamHⅠ, respectively; in Fig.C, 1, 2, 3 represent enzyme digestion of pVAX1-E0-IRES-gD, pVAX1-E0-IRES, gD by EcoRⅠand PstⅠ, respectively圖2 重組質粒的雙酶切鑒定Fig.2 Enzyme digestion and identification of recombinant plasmid

2.3 重組質粒在293T細胞中的表達情況

間接免疫熒光結果見圖3。質粒轉染48 h后進行間接免疫熒光試驗，在倒置顯微鏡下觀察免疫熒光產生情況。結果顯示，分別使用IBRV陽性血清和BVDV陽性血清作為一抗，使用兔抗牛IgG-FITC作為二抗，轉染pVAX1-E0-IRES-gD重組質粒的細胞中有綠色熒光產生；而pVAX1-IRES空載體組和正常細胞組未見綠色熒光。

A、C、E、G分別為pVAX1-E0-IRES-gD轉染組(一抗BVDV陽性血清)、pVAX1-E0-IRES-gD轉染組(一抗IBRV陽性血清)、pVAX1-IRES空載體轉染組、正常細胞對照組在熒光激發(fā)下的狀態(tài)；B、D、F、H分別為A、C、E、G各組細胞未被熒光激發(fā)的狀態(tài)A, C, E, G are cells transfected by pVAX1-E0-IRES-gD(Primary antibody added with BVDV positive serum)， cells transfected by pVAX1-E0-IRES-gD(Primary antibody added with IBRV positive serum), cells transfected by no-carrier of pVAX1- IRES vector, the normal MDBK cells under fluorescence; B, D, F, H are negative control for A, C, E, G圖3 重組質粒在293T細胞中的表達情況Fig.3 Expression of recombinant plasmid in 293T cells

2.4 免疫小鼠血清中抗體產生情況

使用ELISA方法檢測免疫小鼠血清中抗體產生情況，結果以各樣品的OD450 nm值表示。試驗結果顯示，在首免后7 d，相較于空載體組及PBS對照組，不同劑量的pVAX1-E0-IRES-gD重組質粒組抗E0和gD IgG抗體水平均有所增長，且200 μg免疫組極顯著性增加(P<0.01)，提示高劑量免疫組能夠迅速產生較高水平的抗體。自首免后14～42 d，高劑量免疫組抗E0和gD IgG抗體的增長水平持續(xù)極顯著性高于其余兩劑量組(P<0.01)，而中低兩劑量組抗體水平無顯著性差異(P>0.05)。此外，自首免后28 d至試驗結束，BVD-IBR滅活疫苗免疫組的抗E0和gD IgG抗體水平和200 μg免疫組無顯著性差異(P>0.05)，且代表抗E0 IgG抗體水平的OD450 nm均值在試驗最后1 d還略高于BVD-IBR滅活苗免疫組。

2.5 免疫小鼠脾淋巴細胞增殖試驗

使用MTT法檢測ConA刺激的小鼠脾淋巴細胞增殖情況。結果顯示，自首免后14～42 d，相較于pVAX1-IRES空載體對照組和PBS組，pVAX1-E0-IRES-gD重組質粒組和BVD-IBR滅活苗免疫組的脾淋巴細胞增殖能力不斷提高。其中，不同劑量的pVAX1-E0-IRES-gD重組質粒組中以200 μg劑量脾淋巴細胞增殖能力最強，極顯著高于其余兩組(P<0.01)， 100 μg劑量顯著性高于50 μg劑量組(P<0.01)。

2.6 免疫小鼠血清中細胞因子產生情況

采用ELISA方法檢測首免后42 d小鼠血清中IFN-γ和IL-4的含量。分析所得試驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)(表2)，小鼠血清中細胞因子IFN-γ和IL-4含量均表現(xiàn)為200 μg劑量組最高，100 μg劑量組次之，50 μg劑量組最低，高劑量極顯著高于其余兩組(P<0.01)，中劑量組和低劑量組無顯著性差異(P>0.05)，且中高劑量組顯著性高于空載體組和PBS組。高劑量組與BVD-IBR滅活苗免疫組無顯著性差異(P>0.05)。將不同試驗組的IFN-γ和IL-4含量單獨比較發(fā)現(xiàn)，IL-4整體含量較高于IFN-γ。

表2 各試驗組小鼠血清內IFN-γ、IL-4檢測情況Table 2 The results of IFN-γ and IL-4 in each experimental mice serum

2.7 免疫小鼠血清中和抗體水平

本試驗對IgG抗體水平較高時期的血清進行體外的病毒中和試驗，試驗結果見表3。首免后42 d的小鼠血清中，除空載體組和PBS組外，其余各試驗組均檢測到中和抗體。隨著真核表達質粒免疫劑量的增加，被檢血清中和抗體效價也呈現(xiàn)出增高的趨勢。血清在1∶64的稀釋度時，200 μg高劑量組和滅活疫苗組的病毒抑制率仍在50%以上，均顯著性高于50 μg低劑量組和100 μg中劑量組(P<0.05)，但兩者之間并無顯著性差異(P>0.05)。

表3 各試驗組小鼠血清內中和抗體水平Table 3 Neutralizing antibody titers of serum in different groups

3 討 論

目前，防控BVD和IBR疫病的主要途徑是疫苗接種，針對這兩類疫病的二聯(lián)滅活苗和弱毒苗已在我國部分牛場得到應用。但從長遠來看，傳統(tǒng)疫苗的使用并不利于BVD和IBR的凈化且制備工藝繁瑣并存在安全隱患，所以高效、安全、易于大量制備的核酸疫苗便成為了當下的研究熱點。本次試驗選用BVDV、IBRV的主要保護性抗原E0、gD，由于抗原性較強，這二者常作為構建核酸疫苗的靶基因。E0基因高度保守，對病毒的感染具有重要的調控作用且有利于病毒的持續(xù)性感染，其所表達的蛋白病毒和細胞接觸過程中的主要結構蛋白，是宿主中和抗體的主要靶標[18]。在IBRV的主要糖蛋白中，gD基因編碼的糖蛋白免疫原性良好[19]，能夠誘導最高水平的血清抗體應答，被認為是制備核酸疫苗的首選蛋白[20]。本試驗構建了真核表達載體pVAX1-IRES，利用IRES元件將BVDVE0和IBRVgD連接到表達載體中，成功構建了重組質粒pVAX1-E0-IRES-gD。IRES元件的存在可以使E0和gD同時進行翻譯，目前已廣泛用于表達雙目標基因的真核質粒的構建上，通常將其序列插入兩個目標基因序列之間來行使功能[21-22]。pVAX1載體也已廣泛用于重組質粒的構建，該載體含有多個克隆酶切位點，允許同時克隆多個大片段的目的基因[23-24]，本研究選用其中的AfIⅡ、PstⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ四個酶切位點來完成目的基因和其他序列的導入。此外，由于pVAX1載體屬于非融合載體，在目的基因前插入Kozak序列能夠增加其轉錄和翻譯能力[25]。因此，在合成引物時給E0和gD序列前端突變了Kozak序列，以保證兩段基因的高效表達。另外，pVAX1具有的強啟動子pCMV和BGH poly A信號可以在哺乳動物細胞中高水平的表達重組蛋白，是其主要優(yōu)勢所在[26-27]。將重組質粒pVAX1-E0-IRES-gD轉染至293T細胞，利用間接免疫熒光法檢測其免疫原性，結果顯示，pVAX1-E0-IRES-gD中的E0和gD蛋白均得到表達。

同一時間大寫字母無相同者為差異極顯著(P<0.01)；同一時間小寫字母無相同者為差異顯著(P<0.05)The difference in capital letters at the same time is extremely significant (P<0.01); the difference in lowercase capital letters at the same time is significant (P<0.05)圖4 不同免疫組E0抗體檢測結果Fig.4 The results of E0 antibody test in different immune groups

同一時間大寫字母無相同者為差異極顯著(P<0.01)；同一時間小寫字母無相同者為差異顯著(P<0.05)The difference in capital letters at the same time is extremely significant (P<0.01); the difference in lowercase letters at the same time is significant (P<0.05)圖6 小鼠脾淋巴細胞增殖情況Fig.6 The proliferation of mouse spleen lymphocytes

為了鑒定pVAX1-E0-IRES-gD重組質粒的免疫效應，我們采用肌內注射的方式免疫小鼠，進行小鼠免疫試驗，通過采集小鼠血清和脾，檢測血清內抗體水平、細胞因子含量及脾淋巴細胞增殖情況。試驗數(shù)據(jù)表明，pVAX1-E0-IRES-gD可刺激小鼠同時產生抗E0和gD的IgG抗體，抗體水平隨著免疫時間的延長而升高。國內梁霄勇[28]將E0插入到pVAX1真核表達載體上，構架重組質粒pVAX1-E0，一免后試驗組與空載體抗體水平差異顯著(P<0.05)， 二、三免后抗體水平依舊處于上升階段；Toussaint等[29]外國學者構建了編碼IBRVgD的核酸疫苗并將其注射至牛體內進行試驗，結果發(fā)現(xiàn)，隨著免疫時間的增加，誘導牛的體液免疫和細胞免疫逐漸增強。本研究結果與梁霄勇[28]、Toussaint等[29]的研究相符合。在體外病毒中和試驗后，發(fā)現(xiàn)首免后42 d的小鼠血清中產生了分別針對BVDV和IBRV的中和抗體，且隨著重組質粒免疫劑量的增加其抗體效價也有了顯著提升。雖然BVD-IBR滅活疫苗組中和抗體效價略高于200 μg劑量組，但兩者并無明顯差異，試驗結果與仝曉丹[30]的研究相符合。通過分析不同劑量組的抗體水平，發(fā)現(xiàn)本重組質粒具有劑量依賴性，即免疫劑量越高，其產生的抗體水平越高。細胞因子含量方面，首免后42 d的小鼠血清中均產生了IFN-γ和IL-4，說明重組質粒免疫小鼠后可刺激機體同時產生Th1和Th2型免疫應答。將不同試驗組的IFN-γ和IL-4含量單獨比較發(fā)現(xiàn)，IL-4整體含量較高于IFN-γ。另外，脾淋巴細胞增殖能力也隨著免疫時間而持續(xù)增強。

多價核酸疫苗的出現(xiàn)不僅降低了疫苗的接種成本，還緩解了動物的接種壓力，可謂一舉兩得。本試驗構建的pVAX1-E0-IRES-gD可以刺激小鼠產生特異性抗體及細胞因子，為BVD-IBR二聯(lián)核酸疫苗的研究提供了參考。同時，試驗中也存在一些不足之處，在小鼠免疫試驗中應該通過更準確的梯度試驗來確定重組質粒用量；應該在不同時間點來分析細胞因子的含量變化；要應用于實際生產時還需通過宿主動物攻毒試驗等來確定其免疫效應，以上問題還需要進一步研究解決。

4 結 論

構建同時表達牛病毒性腹瀉病毒E0和牛傳染性鼻氣管炎病毒gD基因的重組質粒pVAX1-E0-IRES-gD，體外表達檢測證明目的蛋白具有良好的反應原性，動物免疫試驗證明其能刺激機體產生良好免疫應答。