馬小靜，李夢瑩，張淮瑜，宋阿北，許立華，吳心華，張巧娥，李繼東

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea，BVD)和牛傳染性鼻氣管炎(infectious bovine rhinotracheities，IBR)是危害牛等反芻動(dòng)物的兩類重要疫病，病原分別為牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)和牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus，IBRV)。BVDV和IBRV?；旌细腥九Ｈ?，引起多種臨床癥狀，對奶牛及肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了很大危害[1-3]。目前臨床尚無有效治療藥物，國內(nèi)早期通常采用接種豬瘟兔化弱毒疫苗來預(yù)防BVD的發(fā)生[4]。2016年，商品化的BVD疫苗出現(xiàn)，為BVD-IBR二聯(lián)滅活苗，這也填補(bǔ)了國內(nèi)IBR疫苗的空白[5]。傳統(tǒng)疫苗的出現(xiàn)有效地降低了BVD和IBR的發(fā)病率和防治成本，但同時(shí)也帶來一些無法避免的問題。滅活疫苗的優(yōu)點(diǎn)在于安全性較高[6]，但他們通常誘導(dǎo)較弱的中和抗體反應(yīng)和較短的保護(hù)期[7]。相較于滅活苗，弱毒疫苗雖然能產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫力且免疫保護(hù)周期較長[8]，但其存在較大的安全隱患，可能會引起流產(chǎn)、胎兒感染等不良反應(yīng)[9]。為了探究更具前瞻性的防治措施，具有免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間長、安全性高、容易改造、儲存運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)的核酸疫苗[10-12]成為了當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。雖然也有學(xué)者擔(dān)心重組質(zhì)粒有可能整合到宿主基因組，但迄今為止還沒有試驗(yàn)數(shù)據(jù)來證實(shí)這種危險(xiǎn)性[13]。

目前，國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表了較多針對BVD或IBR的核酸疫苗的研究，普遍利用其優(yōu)勢抗原基因作為核酸疫苗的靶基因且得到了較好的研究成果。國內(nèi)石明[14]對作為核酸疫苗靶基因的BVDV囊膜蛋白E0和E2的疫苗免疫效果進(jìn)行了綜合評價(jià)，結(jié)果顯示可分別誘導(dǎo)較好的體液免疫和細(xì)胞免疫。國外Deshpande等[15]發(fā)現(xiàn)利用攜帶IBRVgD基因的質(zhì)粒表達(dá)gD蛋白，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抵抗IBRV的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，為機(jī)體提供保護(hù)力；除gD外，以gC和gE為靶基因的核酸疫苗也得到研究，國內(nèi)張帆等[16-17]先后構(gòu)建IBRVgC、IBRVgE真核表達(dá)載體，并對其反應(yīng)原性進(jìn)行了研究。但是，對能夠同時(shí)防制BVD和IBR的二聯(lián)核酸疫苗的研究卻未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)計(jì)劃擴(kuò)增BVDVE0和IBRVgD目的基因，將兩者插入pVAX1-IRES中，構(gòu)建pVAX1-E0-IRES-gD重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測E0和gD在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況。此外，將pVAX1-E0-IRES-gD肌內(nèi)注射免疫小鼠，研究其免疫效應(yīng)。通過上述試驗(yàn)過程及結(jié)果，為BVD-IBR二聯(lián)核酸疫苗的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒株、質(zhì)粒、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BVDV NADL病毒株、IBRV HVRI-002病毒株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；pVAX1質(zhì)粒、MDBK細(xì)胞、BVDV和IBRV牛源陽性血清均由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α購自索萊寶生物科技有限公司；293T細(xì)胞株由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室饋贈；18～22日齡SPF級小鼠，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；BVD-IBR二聯(lián)滅活苗(商品名：哞樂優(yōu))購自金宇保靈有限公司。

1.2 主要試劑及試劑盒

PBST、BSA、TMB顯色液、PEG6000(索萊寶)；限制性內(nèi)切酶(NEB)；PrimeSTAR HS DNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶、DNA T4連接酶(TaKaRa)；兔抗牛IgG-FITC熒光二抗、HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG(Abcam)；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(Tigen)；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒(Thermo Fisher)；小鼠γ干擾素(IFN-γ)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素4(IL-4)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Elabscience)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中的參考序列，利用Prime premier設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增BVDVE0、IBRVgD基因和IRES元件的引物(表1)。在擴(kuò)增BVDVE0基因和IBRVgD基因的5′端均引入了Kozak序列，這段序列的加入有助于后期重組質(zhì)粒的表達(dá)等試驗(yàn)順利進(jìn)行。E0基因預(yù)期擴(kuò)增大小為706 bp，包括684 bp的基因編碼區(qū)和酶切位點(diǎn)及Kozak序列；gD基因預(yù)期擴(kuò)增大小為1 275 bp，包括1 254 bp的基因編碼區(qū)和酶切位點(diǎn)及Kozak序列。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 試驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primers sequences

1.4 目的基因的克隆

取出-80 ℃保存的BVDV和IBRV細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，利用DNA/RNA提取試劑盒提取病毒基因組。以獲得的IBRV DNA溶液為模板，對gD基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10 μL，dNTP Mixture 4 μL， 上下游引物各0.2 μL，基因組1.5 μL，ddH2O 34.1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s；55 ℃退火15 s；72 ℃延伸2 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以獲得的BVDV RNA溶液為模板，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA。對E0基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：10×Buffer (Mg2+Plus) 5 μL，dNTP 4 μL，rTaq酶0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 3 μL，RNase free水36.5 μL。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V 30 min，用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的基因E0和gD。

1.5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建

1.5.1 pVAX1-IRES載體的構(gòu)建與鑒定 將本實(shí)驗(yàn)室保存的pIRES-AcGFP1質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增IRES序列。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃ 變性10 s；60 ℃退火15 s；72 ℃延伸1 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)體系：5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，上下游引物各0.2 μL，pIRES-AcGFP1質(zhì)粒1 μL，ddH2O 34.6 μL，合計(jì)50 μL。PCR反應(yīng)后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，110 V 30 min，用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化IRES片段，利用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切pVAX1和IRES后，進(jìn)行連接與轉(zhuǎn)化。產(chǎn)物經(jīng)雙酶切鑒定并送至上海生工生物工程公司測序。

1.5.2 pVAX1-E0-IRES-gD重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 用AfIⅡ、BamHⅠ同時(shí)雙酶切pVAX1-IRES和E0基因后，進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化。產(chǎn)物經(jīng)雙酶切鑒定，鑒定陽性者送往上海生工生物工程公司測序，得到重組質(zhì)粒pVAX1-E0-IRES。將pVAX1-E0-IRES和gD基因均使用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切后，進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化。產(chǎn)物經(jīng)雙酶切鑒定，鑒定陽性者送往上海生工生物工程公司測序，得到重組質(zhì)粒pVAX1-E0-IRES-gD。

1.6 間接免疫熒光法檢測目的基因的表達(dá)

依照天根無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒操作步驟提取空載體pVAX1-IRES和重組質(zhì)粒pVAX1-E0-IRES-gD，調(diào)整兩者質(zhì)量濃度為1.0 μg·μL-1。復(fù)蘇293T細(xì)胞并將其接種至六孔板中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁75%～85%。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pVAX1-E0-IRES-gD和空載體pVAX1-IRES按照Lipofectamine 3000試劑說明書分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，另設(shè)空白對照。轉(zhuǎn)染48 h后，利用一抗(BVDV、IBRV陽性血清)和二抗(兔抗牛IgG-FITC)進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)，檢測E0和gD基因在293T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況。

1.7 小鼠免疫試驗(yàn)

1.7.1 動(dòng)物免疫試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將108只SPF級小鼠分為6個(gè)試驗(yàn)組，Ⅰ～Ⅲ組為重組質(zhì)粒pVAX1-E0-IRES-gD注射組，質(zhì)粒注射量分別為 50、100和200 μg·只-1；Ⅳ組為空載體pVAX1-IRES注射組(100 μg·只-1)；Ⅴ組為PBS對照組(0.2 mL)；Ⅵ組為BVD-IBR滅活苗注射組(0.2 mL)。免疫方式均為小鼠腿部肌內(nèi)注射，初次免疫2周后加強(qiáng)免疫1次。各組小鼠分別于首免前0 d，首免后7、14、21、28、42 d進(jìn)行頜下靜脈采血，收集血清保存于-20 ℃ 備用；在0、14、28、42 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)選取2只小鼠，頸椎脫臼法處死后無菌采取脾，用于隨后的脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。所有動(dòng)物試驗(yàn)均嚴(yán)格按照國家研究委員會實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南的要求進(jìn)行，并已提交寧夏大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理與福利委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：NXU-ACAU-2019-010)。

1.7.2 免疫小鼠血清中g(shù)D和E0抗體水平檢測 采用ELISA方法分別檢測兩次免疫后的小鼠血清中g(shù)D和E0特異性抗體水平的變化。對BVDV和IBRV進(jìn)行增殖，將病毒培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次，利用PEG6000進(jìn)行病毒的純化。將純化好的病毒按照1∶100 的比例包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜。PBST洗板3次， 用含1% BSA的PBST作為封閉液，37 ℃作用2 h，洗去封閉液。加入1∶200倍稀釋的待檢血清，37 ℃作用1 h后洗板5次。加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG酶標(biāo)二抗(1∶8 000)，37 ℃作用1 h。最后依次加入TMB顯色液和終止液(2 mol·L-1硫酸)。用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔OD值。

1.7.3 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 采用噻唑藍(lán)比色法(MTT)檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況。無菌采取小鼠脾進(jìn)行淋巴細(xì)胞分離并制備脾淋巴細(xì)胞懸液，用1640完全培養(yǎng)液調(diào)整懸液中細(xì)胞數(shù)至1×106個(gè)·mL-1。按每孔100 μL依次加入96孔板中，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。加入終質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的ConA溶液，輕輕混勻后置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在結(jié)束培養(yǎng)前4 h取出細(xì)胞培養(yǎng)板，輕輕吸出上清液后加入5 mg·mL-1的MTT溶液10 μL·孔-1，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入100 μL DMSO以終止反應(yīng)。震蕩15 min后測定各孔OD490 nm值。

1.7.4 免疫小鼠血清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4檢測 參照小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒和小鼠IL-4酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書，檢測小鼠首免后42 d采集的血清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的含量。

1.7.5 免疫小鼠血清中的中和抗體檢測 依照微量血清中和試驗(yàn)(固定病毒-稀釋血清法)對免疫小鼠血清中的中和抗體水平進(jìn)行檢測。將首免后42 d的小鼠血清60 ℃滅活30 min，自1∶2開始進(jìn)行2倍稀釋。稀釋好的血清分別與200 TCID50的BVDV NADL病毒株、IBRV HVRI-002病毒株等體積混合于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37 ℃溫箱中孵育1 h，每孔加入定量MDBK細(xì)胞懸液。同時(shí)設(shè)病毒回歸試驗(yàn)作為參考。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，逐日觀察細(xì)胞病變情況。采用Reed-Muench兩氏法計(jì)算被檢血清的中和抗體效價(jià)。

1.7.6 數(shù)據(jù)處理 使用EXCEL軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理；利用SPSS 20.0對各組內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析；采用GraphPad Prism 8.0作圖。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增

以提取的BVDV cDNA溶液和IBRV DNA溶液為模板分別擴(kuò)增E0和gD基因。取PCR產(chǎn)物各0.5 μL，進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳(圖1)。電泳圖顯示E0片段約為706 bp，gD片段約為1 275 bp， 與預(yù)期大小相符。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2000)；1. BVDV陰性對照；2. BVDV NADL株；3. IBRV HVRI-002株；4. IBRV陰性對照M. DNA marker (2000); 1. BVDV negative control; 2. BVDV NADL strain; 3. IBRV HVRI-002 strain; 4. IBRV negative control圖1 BVDV E0基因(A)、IBRV gD基因(B)的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of BVDV E0 (A), IBRV gD (B)

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

對構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(圖2)，雙酶切鑒定陽性者送上海生工測序。結(jié)果顯示，pVAX1-E0-IRES重組質(zhì)粒中包含E0基因編碼區(qū)684 bp，AfIⅡ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)及Kozak序列均得到正確引入，說明E0序列正確插入pVAX1-IRES中IRES序列的上游區(qū)域；pVAX1-E0-IRES-gD中包含gD基因編碼區(qū)1 254 bp，EcoRⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)和Kozak序列均得到正確引入，說明gD序列正確插入pVAX1-E0-IRES中IRES片段的下游區(qū)域，成功構(gòu)建pVAX1-E0-IRES-gD真核表達(dá)載體。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(8000)；A圖中1、2、3分別為BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切pVAX1-IRES、pVAX1、IRES的PCR產(chǎn)物；B圖中1、2、3分別為AfIⅡ和BamHⅠ雙酶切pVAX1-E0-IRES、pVAX1-IRES、E0的PCR產(chǎn)物；C圖中1、2、3分別為EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切pVAX1-E0-IRES-gD、pVAX1-E0-IRES、gD 的PCR產(chǎn)物M. DNA marker (2000); in Fig.A, 1, 2, 3 represent enzyme digestion of pVAX1-IRES, pVAX1, IRES by BamHⅠand EcoRⅠ, respectively; in Fig.B, 1, 2, 3 represent enzyme digestion of pVAX1-E0-IRES, pVAX1-IRES, E0 by AfIⅡand BamHⅠ, respectively; in Fig.C, 1, 2, 3 represent enzyme digestion of pVAX1-E0-IRES-gD, pVAX1-E0-IRES, gD by EcoRⅠand PstⅠ, respectively圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.2 Enzyme digestion and identification of recombinant plasmid

2.3 重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況

間接免疫熒光結(jié)果見圖3。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，在倒置顯微鏡下觀察免疫熒光產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示，分別使用IBRV陽性血清和BVDV陽性血清作為一抗，使用兔抗牛IgG-FITC作為二抗，轉(zhuǎn)染pVAX1-E0-IRES-gD重組質(zhì)粒的細(xì)胞中有綠色熒光產(chǎn)生；而pVAX1-IRES空載體組和正常細(xì)胞組未見綠色熒光。

A、C、E、G分別為pVAX1-E0-IRES-gD轉(zhuǎn)染組(一抗BVDV陽性血清)、pVAX1-E0-IRES-gD轉(zhuǎn)染組(一抗IBRV陽性血清)、pVAX1-IRES空載體轉(zhuǎn)染組、正常細(xì)胞對照組在熒光激發(fā)下的狀態(tài)；B、D、F、H分別為A、C、E、G各組細(xì)胞未被熒光激發(fā)的狀態(tài)A, C, E, G are cells transfected by pVAX1-E0-IRES-gD(Primary antibody added with BVDV positive serum)， cells transfected by pVAX1-E0-IRES-gD(Primary antibody added with IBRV positive serum), cells transfected by no-carrier of pVAX1- IRES vector, the normal MDBK cells under fluorescence; B, D, F, H are negative control for A, C, E, G圖3 重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.3 Expression of recombinant plasmid in 293T cells

2.4 免疫小鼠血清中抗體產(chǎn)生情況

使用ELISA方法檢測免疫小鼠血清中抗體產(chǎn)生情況，結(jié)果以各樣品的OD450 nm值表示。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在首免后7 d，相較于空載體組及PBS對照組，不同劑量的pVAX1-E0-IRES-gD重組質(zhì)粒組抗E0和gD IgG抗體水平均有所增長，且200 μg免疫組極顯著性增加(P<0.01)，提示高劑量免疫組能夠迅速產(chǎn)生較高水平的抗體。自首免后14～42 d，高劑量免疫組抗E0和gD IgG抗體的增長水平持續(xù)極顯著性高于其余兩劑量組(P<0.01)，而中低兩劑量組抗體水平無顯著性差異(P>0.05)。此外，自首免后28 d至試驗(yàn)結(jié)束，BVD-IBR滅活疫苗免疫組的抗E0和gD IgG抗體水平和200 μg免疫組無顯著性差異(P>0.05)，且代表抗E0 IgG抗體水平的OD450 nm均值在試驗(yàn)最后1 d還略高于BVD-IBR滅活苗免疫組。

2.5 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

使用MTT法檢測ConA刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，自首免后14～42 d，相較于pVAX1-IRES空載體對照組和PBS組，pVAX1-E0-IRES-gD重組質(zhì)粒組和BVD-IBR滅活苗免疫組的脾淋巴細(xì)胞增殖能力不斷提高。其中，不同劑量的pVAX1-E0-IRES-gD重組質(zhì)粒組中以200 μg劑量脾淋巴細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，極顯著高于其余兩組(P<0.01)， 100 μg劑量顯著性高于50 μg劑量組(P<0.01)。

2.6 免疫小鼠血清中細(xì)胞因子產(chǎn)生情況

采用ELISA方法檢測首免后42 d小鼠血清中IFN-γ和IL-4的含量。分析所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)(表2)，小鼠血清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4含量均表現(xiàn)為200 μg劑量組最高，100 μg劑量組次之，50 μg劑量組最低，高劑量極顯著高于其余兩組(P<0.01)，中劑量組和低劑量組無顯著性差異(P>0.05)，且中高劑量組顯著性高于空載體組和PBS組。高劑量組與BVD-IBR滅活苗免疫組無顯著性差異(P>0.05)。將不同試驗(yàn)組的IFN-γ和IL-4含量單獨(dú)比較發(fā)現(xiàn)，IL-4整體含量較高于IFN-γ。

表2 各試驗(yàn)組小鼠血清內(nèi)IFN-γ、IL-4檢測情況Table 2 The results of IFN-γ and IL-4 in each experimental mice serum

2.7 免疫小鼠血清中和抗體水平

本試驗(yàn)對IgG抗體水平較高時(shí)期的血清進(jìn)行體外的病毒中和試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。首免后42 d的小鼠血清中，除空載體組和PBS組外，其余各試驗(yàn)組均檢測到中和抗體。隨著真核表達(dá)質(zhì)粒免疫劑量的增加，被檢血清中和抗體效價(jià)也呈現(xiàn)出增高的趨勢。血清在1∶64的稀釋度時(shí)，200 μg高劑量組和滅活疫苗組的病毒抑制率仍在50%以上，均顯著性高于50 μg低劑量組和100 μg中劑量組(P<0.05)，但兩者之間并無顯著性差異(P>0.05)。

表3 各試驗(yàn)組小鼠血清內(nèi)中和抗體水平Table 3 Neutralizing antibody titers of serum in different groups

3 討 論

目前，防控BVD和IBR疫病的主要途徑是疫苗接種，針對這兩類疫病的二聯(lián)滅活苗和弱毒苗已在我國部分牛場得到應(yīng)用。但從長遠(yuǎn)來看，傳統(tǒng)疫苗的使用并不利于BVD和IBR的凈化且制備工藝繁瑣并存在安全隱患，所以高效、安全、易于大量制備的核酸疫苗便成為了當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。本次試驗(yàn)選用BVDV、IBRV的主要保護(hù)性抗原E0、gD，由于抗原性較強(qiáng)，這二者常作為構(gòu)建核酸疫苗的靶基因。E0基因高度保守，對病毒的感染具有重要的調(diào)控作用且有利于病毒的持續(xù)性感染，其所表達(dá)的蛋白病毒和細(xì)胞接觸過程中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是宿主中和抗體的主要靶標(biāo)[18]。在IBRV的主要糖蛋白中，gD基因編碼的糖蛋白免疫原性良好[19]，能夠誘導(dǎo)最高水平的血清抗體應(yīng)答，被認(rèn)為是制備核酸疫苗的首選蛋白[20]。本試驗(yàn)構(gòu)建了真核表達(dá)載體pVAX1-IRES，利用IRES元件將BVDVE0和IBRVgD連接到表達(dá)載體中，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVAX1-E0-IRES-gD。IRES元件的存在可以使E0和gD同時(shí)進(jìn)行翻譯，目前已廣泛用于表達(dá)雙目標(biāo)基因的真核質(zhì)粒的構(gòu)建上，通常將其序列插入兩個(gè)目標(biāo)基因序列之間來行使功能[21-22]。pVAX1載體也已廣泛用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建，該載體含有多個(gè)克隆酶切位點(diǎn)，允許同時(shí)克隆多個(gè)大片段的目的基因[23-24]，本研究選用其中的AfIⅡ、PstⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ四個(gè)酶切位點(diǎn)來完成目的基因和其他序列的導(dǎo)入。此外，由于pVAX1載體屬于非融合載體，在目的基因前插入Kozak序列能夠增加其轉(zhuǎn)錄和翻譯能力[25]。因此，在合成引物時(shí)給E0和gD序列前端突變了Kozak序列，以保證兩段基因的高效表達(dá)。另外，pVAX1具有的強(qiáng)啟動(dòng)子pCMV和BGH poly A信號可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平的表達(dá)重組蛋白，是其主要優(yōu)勢所在[26-27]。將重組質(zhì)粒pVAX1-E0-IRES-gD轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，利用間接免疫熒光法檢測其免疫原性，結(jié)果顯示，pVAX1-E0-IRES-gD中的E0和gD蛋白均得到表達(dá)。

同一時(shí)間大寫字母無相同者為差異極顯著(P<0.01)；同一時(shí)間小寫字母無相同者為差異顯著(P<0.05)The difference in capital letters at the same time is extremely significant (P<0.01); the difference in lowercase capital letters at the same time is significant (P<0.05)圖4 不同免疫組E0抗體檢測結(jié)果Fig.4 The results of E0 antibody test in different immune groups

同一時(shí)間大寫字母無相同者為差異極顯著(P<0.01)；同一時(shí)間小寫字母無相同者為差異顯著(P<0.05)The difference in capital letters at the same time is extremely significant (P<0.01); the difference in lowercase letters at the same time is significant (P<0.05)圖6 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況Fig.6 The proliferation of mouse spleen lymphocytes

為了鑒定pVAX1-E0-IRES-gD重組質(zhì)粒的免疫效應(yīng)，我們采用肌內(nèi)注射的方式免疫小鼠，進(jìn)行小鼠免疫試驗(yàn)，通過采集小鼠血清和脾，檢測血清內(nèi)抗體水平、細(xì)胞因子含量及脾淋巴細(xì)胞增殖情況。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，pVAX1-E0-IRES-gD可刺激小鼠同時(shí)產(chǎn)生抗E0和gD的IgG抗體，抗體水平隨著免疫時(shí)間的延長而升高。國內(nèi)梁霄勇[28]將E0插入到pVAX1真核表達(dá)載體上，構(gòu)架重組質(zhì)粒pVAX1-E0，一免后試驗(yàn)組與空載體抗體水平差異顯著(P<0.05)， 二、三免后抗體水平依舊處于上升階段；Toussaint等[29]外國學(xué)者構(gòu)建了編碼IBRVgD的核酸疫苗并將其注射至牛體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著免疫時(shí)間的增加，誘導(dǎo)牛的體液免疫和細(xì)胞免疫逐漸增強(qiáng)。本研究結(jié)果與梁霄勇[28]、Toussaint等[29]的研究相符合。在體外病毒中和試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)首免后42 d的小鼠血清中產(chǎn)生了分別針對BVDV和IBRV的中和抗體，且隨著重組質(zhì)粒免疫劑量的增加其抗體效價(jià)也有了顯著提升。雖然BVD-IBR滅活疫苗組中和抗體效價(jià)略高于200 μg劑量組，但兩者并無明顯差異，試驗(yàn)結(jié)果與仝曉丹[30]的研究相符合。通過分析不同劑量組的抗體水平，發(fā)現(xiàn)本重組質(zhì)粒具有劑量依賴性，即免疫劑量越高，其產(chǎn)生的抗體水平越高。細(xì)胞因子含量方面，首免后42 d的小鼠血清中均產(chǎn)生了IFN-γ和IL-4，說明重組質(zhì)粒免疫小鼠后可刺激機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生Th1和Th2型免疫應(yīng)答。將不同試驗(yàn)組的IFN-γ和IL-4含量單獨(dú)比較發(fā)現(xiàn)，IL-4整體含量較高于IFN-γ。另外，脾淋巴細(xì)胞增殖能力也隨著免疫時(shí)間而持續(xù)增強(qiáng)。

多價(jià)核酸疫苗的出現(xiàn)不僅降低了疫苗的接種成本，還緩解了動(dòng)物的接種壓力，可謂一舉兩得。本試驗(yàn)構(gòu)建的pVAX1-E0-IRES-gD可以刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體及細(xì)胞因子，為BVD-IBR二聯(lián)核酸疫苗的研究提供了參考。同時(shí)，試驗(yàn)中也存在一些不足之處，在小鼠免疫試驗(yàn)中應(yīng)該通過更準(zhǔn)確的梯度試驗(yàn)來確定重組質(zhì)粒用量；應(yīng)該在不同時(shí)間點(diǎn)來分析細(xì)胞因子的含量變化；要應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)時(shí)還需通過宿主動(dòng)物攻毒試驗(yàn)等來確定其免疫效應(yīng)，以上問題還需要進(jìn)一步研究解決。

4 結(jié) 論

構(gòu)建同時(shí)表達(dá)牛病毒性腹瀉病毒E0和牛傳染性鼻氣管炎病毒gD基因的重組質(zhì)粒pVAX1-E0-IRES-gD，體外表達(dá)檢測證明目的蛋白具有良好的反應(yīng)原性，動(dòng)物免疫試驗(yàn)證明其能刺激機(jī)體產(chǎn)生良好免疫應(yīng)答。