許文娟 趙 晗 孔彩霞 韓 芳 劉文鵬 丁葵英 田國(guó)寧 段效輝

1.濰坊海關(guān) 山東濰坊 261041 2.合肥海關(guān) 安徽合肥 230000 3.煙臺(tái)海關(guān) 山東煙臺(tái) 264000

近年來(lái)，人們對(duì)于肉類產(chǎn)品安全性的關(guān)注從化學(xué)有害物殘留、微生物超標(biāo)擴(kuò)展到廉價(jià)肉摻假問(wèn)題[1]。“假肉門”、國(guó)外“僵尸肉”問(wèn)題的曝光，使得人們對(duì)于肉類安全更加擔(dān)憂。肉類摻假問(wèn)題不僅關(guān)乎食品安全、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)貿(mào)易等問(wèn)題，更會(huì)危害消費(fèi)者的身體健康，尤其是對(duì)某種肉類產(chǎn)品過(guò)敏的人群。在清真認(rèn)證肉類食品中，摻入豬肉還會(huì)涉及宗教信仰等問(wèn)題，妨礙社會(huì)安定和諧[2～4]。此外，我國(guó)近年來(lái)肉類進(jìn)出口貿(mào)易往來(lái)不斷擴(kuò)大，《中華人民共和國(guó)進(jìn)出口稅則》中，海關(guān)對(duì)不同種類的進(jìn)出口肉也有不同的稅率要求。不論從社會(huì)穩(wěn)定、消費(fèi)者身體健康，還是進(jìn)出口貿(mào)易監(jiān)管方面，對(duì)肉及肉制品進(jìn)行摻假成分鑒別具有重要意義。

由于肉類產(chǎn)品種類繁多、成分復(fù)雜，而且摻雜物質(zhì)種類多，外觀組成和理化性質(zhì)又很接近，通常很難用一般的化學(xué)方法判定真?zhèn)蝃5]。目前，已報(bào)道的食品摻假檢測(cè)方法多達(dá)15種以上，從傳統(tǒng)的感官鑒定到基于核酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、基于抗原抗體的酶聯(lián)免疫(ELISA)、基于特征肽段檢測(cè)的質(zhì)譜分析等[6，7]。

本文將對(duì)肉類摻假鑒別中研究較多的6種常用技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行介紹，便于相關(guān)工作者根據(jù)實(shí)際工作選擇適合的方法開(kāi)展工作。

1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，是基于核酸的檢測(cè)手段，具體原理是在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA片段為模板，以預(yù)先設(shè)計(jì)好的特異性引物為起點(diǎn)，經(jīng)過(guò)高溫變性、低溫復(fù)性、適溫延伸等操作步驟，循環(huán)多次以后，體外擴(kuò)增產(chǎn)生與母鏈DNA模板片段互補(bǔ)的子鏈DNA片段的技術(shù)，主要又可分為熒光定量PCR、數(shù)字PCR技術(shù)等[8～10]。以核酸為基礎(chǔ)來(lái)鑒別肉及肉制品是否摻假，可以避免被檢對(duì)象由于加工過(guò)程出現(xiàn)的檢測(cè)誤差，穩(wěn)定性較高，靈敏度好。

PCR是目前肉類鑒別應(yīng)用最廣泛和成熟的方法之一。劉岑杰[11](2015)等采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了肉制品中的鴨源性成分，該文獻(xiàn)建立的方法檢出限低至0.01%，因此靈敏度好，利用該方法對(duì)市售的牛肉片、羊肉串等肉類樣品進(jìn)行盲樣檢測(cè)，結(jié)果各樣品均發(fā)現(xiàn)了鴨源性成分，為監(jiān)管部門維護(hù)食品市場(chǎng)安全提供了數(shù)據(jù)支持。金鷺[12](2020)等利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(rPCR)結(jié)合微滴式數(shù)字PCR技術(shù)(dd PCR)，基于rPCR定量檢測(cè)數(shù)據(jù)，采用dd PCR建立采集數(shù)據(jù)與羊肉質(zhì)量的數(shù)學(xué)關(guān)系，確立了羊肉含量的定量方法，該方法特異性好，檢出限最低為0.01 ng/μL，能夠?qū)孔畹蜑?%的羊肉進(jìn)行準(zhǔn)確定量。陳曉宇[13](2021)等采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)牛肉及其制品中摻假情況進(jìn)行研究，所建立的方法靈敏度高且重復(fù)性好，通過(guò)對(duì)流通環(huán)節(jié)不同渠道、不同種類的牛肉樣品進(jìn)行動(dòng)物源性成分調(diào)查，發(fā)現(xiàn)市售牛肉及制品的摻假類別主要為豬、雞、鴨或大豆成分。

我國(guó)已將PCR檢測(cè)技術(shù)作為鑒定肉類的標(biāo)準(zhǔn)方法，且以實(shí)時(shí)熒光PCR為主。相繼出臺(tái)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)可以開(kāi)展幾乎所有動(dòng)物源性成分的檢測(cè)，代表性的標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 21104-2007《動(dòng)物源性飼料中反芻動(dòng)物源性成分(牛、羊、鹿)定性檢測(cè)方法PCR方法》、GB/T 38164-2019《常見(jiàn)畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法》、SN/T 2980-2011《動(dòng)物產(chǎn)品中牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》DB15/T 2025-2020《牛和豬源性成分同步檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法》。

PCR技術(shù)適用于多物種的鑒定，且具有靈敏、高效、準(zhǔn)確等顯著優(yōu)點(diǎn)，雖然實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的易交叉污染以及假陽(yáng)性結(jié)果的不足，但存在檢測(cè)成本高，且易受DNA降解、復(fù)雜基質(zhì)干擾檢測(cè)結(jié)果等缺點(diǎn)[14,15]。

2 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)是一種基于抗原-抗體的特異性識(shí)別，與酶的高效催化相結(jié)合的分析方法，具有簡(jiǎn)便性、敏感性和特異性的特點(diǎn)。目前，應(yīng)用于肉類食品鑒定的ELISA方法主要有直接法、間接法、雙抗體夾心法、間接競(jìng)爭(zhēng)法等，這些技術(shù)是通過(guò)定性與定量分析肉類樣品中特異性抗原從而實(shí)現(xiàn)源性鑒別的。近年來(lái)，ELISA技術(shù)在動(dòng)物源性成分鑒別方面得到了廣泛的應(yīng)用[16]。Kang’ethe[17](1982)等便使用間接ELISA技術(shù)檢測(cè)馬肉與牛肉的種屬特異性抗體，并據(jù)此將二者分開(kāi)。駱訓(xùn)國(guó)[18](2010)等采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)豬肉成分，方法的檢測(cè)靈敏度高，最低能檢測(cè)出1%的摻入量。Rencova[19](2000)等基于多克隆抗體建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，用于鑒別經(jīng)過(guò)熱加工的家禽、袋鼠、馬、老鼠的肌肉組織，方法的準(zhǔn)確性較好。

采用酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)肉類摻假最大的缺陷是目的蛋白經(jīng)過(guò)加熱過(guò)程會(huì)變性，無(wú)法通過(guò)抗體進(jìn)行檢測(cè)，有研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物肌肉中的肌紅蛋白(MMb)具有熱穩(wěn)定性，可以基于肌紅蛋白建立識(shí)別方法。侯瑾[20](2018)將羊肌紅蛋白作為特異性指標(biāo)建立了ELISA方法，能夠準(zhǔn)確的定量出混合生肉和混合熟肉中生羊肉、熟羊肉的含量。

酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高，但在蛋白質(zhì)變性上有明顯短板，如果蛋白質(zhì)發(fā)生變性，則ELISA技術(shù)會(huì)受到顯著影響，因?yàn)榭乖贵w的識(shí)別過(guò)程特異性很強(qiáng)，抗原蛋白質(zhì)一旦變性失活，就會(huì)導(dǎo)致抗原-抗體無(wú)法有效識(shí)別[21,22]。

3 重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種新型的體外核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，目前主要有重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)與重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增(RAA)2項(xiàng)技術(shù)[23]。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，雖然二者均基于核酸檢測(cè)，但PCR技術(shù)對(duì)溫度要求高，需要反復(fù)摸索得到反應(yīng)過(guò)程的退火溫度，且程序復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)。而重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)無(wú)需進(jìn)行高溫循環(huán)，恒溫條件下反映20min即可實(shí)現(xiàn)靶基因的有效擴(kuò)增，反應(yīng)時(shí)間縮短了，還可用于結(jié)果的實(shí)時(shí)分析，特別適合對(duì)大量樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)鑒別[24]。我國(guó)已將該技術(shù)制定成檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法，用于政府部門對(duì)動(dòng)物源性成分的監(jiān)管。如SN/T 5227.1-2019《出口食品中雞源性成分快速檢測(cè)重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法(RAA法)》、SN/T 5227.5-2019《出口食品中牛源性成分快速檢測(cè)重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法(RAA法)》等。

郭燕華[25](2017)等基于牛源性線粒體細(xì)胞色素B基因設(shè)計(jì)了特異性的RPA方法，其靈敏度低至0.1ng/μL，可用于鑒定生鮮肉、加工肉制品中的牛源性成分。苗麗[26](2019)等以雞線粒體細(xì)胞色素B基因，設(shè)計(jì)出特異性引物以及exo探針，據(jù)此建立了RAA方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)烏雞肉、高山雞肉、白羽雞肉、野雞肉、蘆花雞肉DNA的快速特異性擴(kuò)增，而對(duì)牛肉、羊肉、豬肉的DNA均未擴(kuò)增，該方法對(duì)雞源性成分的最低檢測(cè)限為0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)速度快且不受場(chǎng)地限制，是一種較具推廣性的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法，但同其他技術(shù)一樣，也易受多種因素干擾，如技術(shù)本身的酶活性、引物探針的設(shè)計(jì)，以及前處理、反應(yīng)溫度等外在的操作因素[27]。此外，該方法反應(yīng)體系固定、試劑成本較高，均限制了其實(shí)用性。

4 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜(MS)方法是基于肉類蛋白或多肽而進(jìn)行的特異性檢測(cè)，相較于DNA，肉制品蛋白質(zhì)的氨基酸序列在加工過(guò)程中更穩(wěn)定[28]。早期基于質(zhì)譜的肉類摻假鑒別主要采用凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，隨著靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，基于串聯(lián)質(zhì)譜的特異肽段檢測(cè)已成為質(zhì)譜技術(shù)鑒別肉類摻假的主要方法。根據(jù)不同來(lái)源的肉類產(chǎn)品中特異性蛋白質(zhì)的差別，在串聯(lián)質(zhì)譜平臺(tái)建立多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方法，一次性同時(shí)檢測(cè)多個(gè)特征肽，從而識(shí)別多個(gè)物種。利用MRM觸發(fā)的增強(qiáng)離子掃描方式可以進(jìn)一步確認(rèn)目標(biāo)蛋白質(zhì)/肽序列，從而有效地去除假陽(yáng)性，增強(qiáng)檢測(cè)結(jié)果的可靠性[29，30]。

Sarah[31](2016)等利用LC-QTOF-MS技術(shù)對(duì)冷凍和煮熟豬肉中的特異性肽進(jìn)行鑒別，建立了多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)7種豬肉樣品中均檢測(cè)出同種特異性肽，為豬源性成分檢測(cè)提供了數(shù)據(jù)支持。李瑩瑩[32](2016)等研究了5種常見(jiàn)肉中種屬特征性肽，基于識(shí)別出的特征性肽段，利用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜對(duì)羊肉和鴨肉混合樣品特征性多肽進(jìn)行定性和定量分析，構(gòu)建的定量離子對(duì)線性關(guān)系良好，檢出限為0.5%。古淑青[33](2018)等采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜對(duì)羊肉、鴨肉、雞肉、豬肉的特征性肽段進(jìn)行了定性和MRM定量分析，該方法對(duì)摻假鴨肉最低檢出限為0.25%、摻入豬肉檢出限為0.17%、雞肉為0.10%。

質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行肉類摻假檢測(cè)，結(jié)果不易受外界干擾，更準(zhǔn)確、可靠性強(qiáng)。但該方法前處理過(guò)程繁瑣、儀器成本較高，無(wú)法滿足快速檢測(cè)的需求，限制了其推廣應(yīng)用。

5 近紅外光譜技術(shù)

隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)的發(fā)展，近紅外光譜技術(shù)(NIR)近年來(lái)快速發(fā)展起來(lái)。采用該技術(shù)無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，根據(jù)不同化合物在特定紅外波長(zhǎng)(780～2 526nm)的吸收情況，直接上樣便可進(jìn)行定性分析，速度快、效率高、成本低、測(cè)試重現(xiàn)性好、測(cè)量方便，成為食品分析領(lǐng)域的一種新選擇[34]。不同種類肉制品在近紅外波段的吸收響應(yīng)情況不同，將大量采集的NIR數(shù)據(jù)與多種數(shù)學(xué)模型結(jié)合處理，可成功用于肉及肉制品的摻假鑒別。

白京[35](2019)等利用近紅外光譜技術(shù)對(duì)解凍牛肉漢堡餅中的豬肉摻假進(jìn)行判別分析，并應(yīng)用偏最小二乘法定量了肥瘦不同的解凍牛肉漢堡餅中的摻假豬肉比例，所建立的判別模型準(zhǔn)確性高。孫乃旭[36](2020)將計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)與NIR結(jié)合檢測(cè)熟兔肉中豬肉的摻假比例，結(jié)果表明偏最小二乘判別分析和反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)2種判別模型準(zhǔn)確度均很高，證明該方法可有效區(qū)分兔肉和豬肉。張玉華[37](2015)等采用近紅外光譜結(jié)合多種數(shù)學(xué)處理方法，建立了牛肉和羊肉中摻雜其它種類肉的鑒別模型，建立的各種模型的準(zhǔn)確度均達(dá)到90%以上，可有效鑒別牛肉、羊肉中的常見(jiàn)摻假肉。

近紅外光譜技術(shù)進(jìn)行肉類摻假鑒別，其建模過(guò)程需要大量的數(shù)據(jù)積累，化學(xué)計(jì)量學(xué)也對(duì)使用者有一定的理論水平要求。但該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)肉類摻假鑒別的無(wú)損檢測(cè)，檢測(cè)速度快，將成為以后研究和應(yīng)用的重點(diǎn)。

6 電子鼻技術(shù)

電子鼻是一種智能仿生設(shè)備，是基于目標(biāo)物的揮發(fā)性成分，采用氣體傳感器建立響應(yīng)曲線快速識(shí)別氣味組成的電子系統(tǒng)。與普通的化學(xué)儀器如色譜儀、光譜儀等不同，電子鼻無(wú)需對(duì)檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行預(yù)處理，即可得到樣品中揮發(fā)成分的整體信息，即“指紋數(shù)據(jù)”，而非被測(cè)樣品各種成分的定性和定量結(jié)果。電子鼻不但能對(duì)不同樣品的氣味信息進(jìn)行對(duì)比分析，還可通過(guò)采集標(biāo)準(zhǔn)樣品的指紋圖譜建立數(shù)據(jù)庫(kù)，繼而利用統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)樣品未知成分進(jìn)行定性和定量分析[38,39]。

不同肉類揮發(fā)性成分組成有所不同，不同時(shí)期、含有不同有害成分的肉類，在特定條件下?lián)]發(fā)出的氣體組成也不同?；诖?，用電子鼻系統(tǒng)進(jìn)行肉類的新鮮度、有害物質(zhì)及摻假檢測(cè)，是完全可行的。Tian[40](2013)等在碎羊肉樣品中分別摻入0%、20%、40%、60%、80%和100%豬肉，采用10種不同的MOS傳感器組成的德國(guó)Airsense公司的PEN2型電子鼻對(duì)其進(jìn)行了鑒別，識(shí)別模型準(zhǔn)確率為97%，此研究對(duì)監(jiān)管食品欺詐具有重要意義。賈洪鋒[41](2011)等研究了電子鼻對(duì)牦牛肉、牛肉中豬肉摻假識(shí)別的可行性，結(jié)果表明不同種類的肉在電子鼻儀器上有不同的特征響應(yīng)圖譜，電子鼻響應(yīng)信號(hào)和豬肉摻假比例的相關(guān)性達(dá)0.976。國(guó)外研究者[42](2011)采用電子鼻檢測(cè)了清真香腸中是否摻入豬肉，從以牛肉、羊肉、雞肉為原料的香腸中挑出摻有豬肉的香腸，并將檢測(cè)結(jié)果與頂空氣相色譜結(jié)果對(duì)比，表明采用電子鼻可以有效識(shí)別出非清真的香腸。田曉靜[43](2013)等采用電子鼻分析摻入雞肉的羊肉糜，結(jié)果基于主成分分析和偏最小二乘回歸建立的數(shù)學(xué)模型，可以有效預(yù)測(cè)混入羊肉中的雞肉糜比例，證明電子鼻在羊肉摻假鑒別中的可行性。

電子鼻技術(shù)用于肉類摻假鑒別具有快速、無(wú)損的顯著優(yōu)勢(shì)，不斷完善的傳感器技術(shù)及化學(xué)計(jì)量學(xué)方法使得該技術(shù)準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性日趨成熟，且該儀器易于便攜化，將更好的適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

7 展望

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)食品質(zhì)量的要求越來(lái)越高。肉及肉制品是人類的重要食物來(lái)源，經(jīng)濟(jì)價(jià)值相對(duì)較高，因此摻假現(xiàn)象屢禁不止。研究準(zhǔn)確、可靠、快速的肉類真假鑒別方法，對(duì)于食品安全、經(jīng)濟(jì)貿(mào)易發(fā)展、社會(huì)穩(wěn)定都具有重要意義。

目前，用于肉類摻假鑒別的技術(shù)有十幾種，不同技術(shù)原理不同，特點(diǎn)各異，使用者可根據(jù)實(shí)際需求選擇合適的方法?；诘鞍椎臋z測(cè)方法，由于蛋白遇高溫會(huì)變性，影響特異性蛋白的識(shí)別，因此不適合深加工肉制品的鑒別，限制了其使用范圍。基于核酸的檢測(cè)技術(shù)，DNA不易受外界因素影響，穩(wěn)定性較高，但試劑盒成本高，且操作復(fù)雜。近紅外光譜、電子鼻技術(shù)都是代表性的基于物種特定指紋信息的快速鑒別技術(shù)，具有無(wú)損、快速的優(yōu)點(diǎn)，能滿足肉類安全檢測(cè)的新要求。但這些技術(shù)模型建立的過(guò)程需要大量數(shù)據(jù)，基礎(chǔ)工作量大，對(duì)化學(xué)計(jì)量學(xué)的要求高。

未來(lái)，對(duì)于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，在準(zhǔn)確可靠的前提下，快速、無(wú)損、低成本的現(xiàn)場(chǎng)鑒別技術(shù)，將是各行業(yè)的共同需求。肉類鑒別方面，在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上，降低試劑盒成本、建立不同種類肉的特異性蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)、全球范圍內(nèi)采集足夠多的肉類光譜和電子鼻等指紋信息、找到更優(yōu)化的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，建立靠譜的數(shù)學(xué)模型，將是研究者繼續(xù)努力的方向。另外，隨著科技水平的發(fā)展，會(huì)有更多的新型技術(shù)用于肉類食品的成分鑒別[44,45]。