楊士杰，劉春盛，高麗環(huán)

0 引言

越來越多的研究表明，長鏈非編碼RNA(lncRNA)在肺癌細胞生長、凋亡和轉(zhuǎn)移等過程中起調(diào)節(jié)作用[1]。許多測序技術(shù)表明，lncRNA在耐藥和敏感肺癌細胞中的表達不同，可能參與肺癌耐藥的分子機制[2]。LncRNA ITGB2-AS1(ITGB2 antisense RNA1)在胰腺導(dǎo)管腺癌[3]、骨肉瘤組織和細胞[4]中表達上調(diào)，下調(diào)或敲低ITGB2-AS1表達可抑制癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移等過程。本研究通過LncBase Predicted v.2預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p與ITGB2-AS1存在結(jié)合位點。miR-338-3p在非小細胞肺癌組織中表達下調(diào)[5]，上調(diào)其表達可抑制癌細胞的增殖和克隆形成，誘導(dǎo)細胞凋亡。但ITGB2-AS1在肺癌中的表達作用，及其與miR-338-3p在肺癌多西他賽耐藥細胞中的關(guān)系目前還尚未可知。本項目主要研究 lncRNA ITGB2-AS1和miR-338-3p對肺癌耐藥細胞A549/DTX增殖、凋亡和多西他賽耐藥性的影響，以期為肺癌的多西他賽耐藥性提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細胞株A549購自ATCC；多西他賽(Docetaxel，DTX)購自江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司；胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)和RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司，引物、si- ITGB2-AS1和陰性對照si-NC、miR-NC、miR-338-3p mimics(miR-338-3p)、pcDNA和pcDNA-ITGB2-AS1、anti-miR-NC和anti-miR-338-3p均購自上海吉瑪制藥有限公司。胰蛋白酶、RNA提取試劑Trizol購自美國Sigma-Aldrich公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購自寶生物工程(大連)有限公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司；CyclinD1、p21、Bax、Bcl-2和GAPDH抗體購自美國Santa cruz公司；細胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；流式細胞儀購自BD公司；Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和A549/DTX耐藥細胞系的建立 將A549細胞培養(yǎng)于含10 % FBS、100 U/ml青霉素-100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)文獻[6]采用DTX小劑量、梯度間歇誘導(dǎo)法使A549細胞產(chǎn)生DTX耐藥性。將A549細胞培養(yǎng)在含0.5 μg/L DTX的RPMI-1640培養(yǎng)基中，24 h后去除死細胞換培養(yǎng)液，用脫藥新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)2周，待細胞恢復(fù)對數(shù)生長期時,再用較高濃度DTX培養(yǎng)液篩選誘導(dǎo)，重復(fù)上述誘導(dǎo)過程，直至A549細胞可穩(wěn)定生長于含終濃度50 μg/L DTX的培養(yǎng)液中，獲得肺癌多西他賽耐藥A549/DTX細胞。

1.2.2 CCK8實驗檢測細胞增殖抑制率和IC50將DTX處理或/和轉(zhuǎn)染后的A549、A549/DTX細胞以3×104個細胞/孔接種于96微孔板中，每孔100 μl細胞，過夜培養(yǎng)后在培養(yǎng)液中加入終濃度為6.25 μg/L、12.5 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的DTX，培養(yǎng)24 h，每孔加入 10 μl CCK8溶液，培養(yǎng)2h，酶標儀測定450 nm 吸光度(A)值。抑制率%=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。以藥物濃度和抑制率分別為橫軸和縱軸，繪制濃度效應(yīng)曲線，計算半數(shù)抑制濃度IC50。

1.2.3 Real-time PCR檢測lncRNA ITGB2-AS1和miR-338-3p的表達 用Trizol試劑提取A549和A549/DTX細胞總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書合成cDNA，取cDNA按照Real-time PCR的說明書進行反應(yīng)檢測lncRNA ITGB2-AS1和miR-338-3p的含量。引 物 如 下：miR-338-3p上游引物：5′-GGGTCCAGCATCAGTGATT-3′，下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCCTCAGA-3′；lncRNA ITGB2-AS1上游引物：5′-AGGAGATGGAACGAGGAAA-3′，下游引物5′- TTAGTGGTCTGCGAAGGTG-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上游引物5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游引物 5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’。運用 2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期A549/DTX細胞以2×105個細胞/孔接種于6孔板中，細胞融合為一層時進行轉(zhuǎn)染。根據(jù)Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑試劑盒說明書將si-NC、si-ITGB2-AS1、miR-NC、miR-338-3p、pcDNA、pcDNA-ITGB2-AS1、si-ITGB2-AS1+anti-miR-NC、si-ITGB2-AS1+anti-miR-338-3p等各組載體或片段轉(zhuǎn)染入A549細胞，分別記為si-NC組、si-ITGB2-AS1組、miR-NC組、miR-338-3p組、pcDNA組、pcDNA-ITGB2-AS1組、si-ITGB2-AS1+anti-miR-NC組、si-ITGB2-AS1+anti-miR-338-3p組。轉(zhuǎn)染48 h，收集細胞。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 將轉(zhuǎn)染后的各組A549/DTX細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用含12.5 μg/L DTX無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，收集細胞，洗滌并稀釋為1×106個細胞/ml，根據(jù)凋亡試劑盒說明書進行操作，取100 μl標記緩沖液重懸細胞，然后加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)和 10 μl碘化丙啶(PI)，室溫避光15 min，流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.6 Western blot實驗 收集轉(zhuǎn)染并經(jīng)12.5 μg/L DTX處理的各組A549/DTX細胞，破碎細胞，收集蛋白并檢測濃度。進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(CyclinD1 1∶2 000、p21 1∶1 000、Bax 1∶2 000、Bcl-2抗體1∶1 000和GAPDH抗體1∶4 000)，置于4 ℃過夜孵育。PBST緩沖液洗膜3次，然后加入稀釋的二抗，室溫孵育1 h，顯影，拍照。以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗 根據(jù)方法1.2.4將構(gòu)建的lncRNA ITGB2-AS1的野生型(WT-ITGB2-AS1)和突變型(MUT-ITGB2-AS1)報告載體分別與miR-NC或miR-338-3p共轉(zhuǎn)染A549/DTX細胞，轉(zhuǎn)染48 h，收集細胞，裂解細胞，離心收集上清，檢測上清中熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 多西他賽對肺癌A549細胞和多西他賽耐藥細胞A549/DTX抑制率的影響 用濃度6.25 μg/L、12.5 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的多西他賽(DTX)分別處理肺癌細胞A549和肺癌多西他賽耐藥細胞A549/DTX，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的升高，DTX對A549細胞和A549/DTX的抑制率逐漸升高，但最高濃度200 μg/L DTX對A549/DTX的抑制率(43.69±4.58)%顯著低于A549(84.25±8.04)%，DTX對A549和A549/DTX細胞的IC50分別為(23.57±2.11) μg/L和(256.80±10.22)μg/L，見表1。說明DTX對A549/DTX細胞的抑制率顯著低于A549細胞。后續(xù)實驗選擇對A549/DTX抑制率在10%左右的DTX濃度12.5 μg/L，此濃度對細胞影響較小。

表1 多西他賽對肺癌A549細胞和肺癌多西他賽耐藥細胞A549/DTX抑制率的影響

2.2 lncRNA ITGB2-AS1和miR-338-3p肺癌A549細胞和肺癌多西他賽耐藥細胞A549/DTX中的表達 檢測肺癌A549細胞和肺癌多西他賽耐藥細胞A549/DTX，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA ITGB2-AS1 在A549/DTX中含量顯著高于A549細胞(P<0.05)，miR-338-3p在A549/DTX中含量顯著低于A549細胞(P<0.05)，見表2。

表2 lncRNA ITGB2-AS1和miR-338-3p在肺癌A549和多西他賽耐藥細胞A549/DTX中的表達

2.3 抑制lncRNA ITGB2-AS1表達聯(lián)合多西他賽(12.5 μg/L)對A549/DTX細胞增殖和凋亡的影響 與DTX+si-NC組相比，DTX+si-ITGB2-AS1組A549/DTX細胞中l(wèi)ncRNA ITGB2-AS1含量降低，細胞抑制率和凋亡率均升高，Cyclin D1和Bcl-2蛋白含量降低，p21和Bax含量升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1和表3。說明抑制ITGB2-AS1聯(lián)合12.5 μg/L DTX處理可抑制A549/DTX細胞增殖，促進細胞凋亡，增強多西他賽對細胞的抑制率。

圖1 抑制lncRNA ITGB2-AS1表達聯(lián)合多西他賽對肺A549/DTX細胞增殖和凋亡的影響注：A.增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達；B.細胞凋亡流式圖

表3 抑制lncRNA ITGB2-AS1表達聯(lián)合多西他賽對A549/DTX細胞增殖、凋亡的影響

2.4 ITGB2-AS1靶向調(diào)控miR-338-3p的表達 通過LncBase Predicted v.2預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p序列中含有與lncRNA ITGB2-AS1互補的結(jié)合位點，見圖2。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果表明，與miR-NC組相比，過表達miR-338-3p組共轉(zhuǎn)染野生型WT-ITGB2-AS1的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著降低(P<0.05)，而突變型MUT-ITGB2-AS1的熒光素酶相對活性無明顯變化，見表4。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達 lncRNA ITGB2-AS1可顯著下調(diào)miR-338-3p含量(P<0.05)；抑制lncRNA ITGB2-AS1可上調(diào)miR-338-3p含量(P<0.05)，見表5。說明lncRNA ITGB2-AS1靶向負調(diào)控miR-338-3p的表達。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖2 ITGB2-AS1的序列中含有與miR-338-3p互補的核苷酸序列

2.5 下調(diào)miR-338-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA ITGB2-AS1對A549/DTX細胞多西他賽耐藥性的影響 與DTX+si-ITGB2-AS1+anti-miR-NC組相比，DTX+si-ITGB2-AS1 + anti-miR-338-3p組A549/DTX細胞中miR-338-3p含量降低，細胞抑制率和凋亡率均降低，CyclinD1和Bcl-2表達量升高，p21和Bax表達量降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與2.3結(jié)果相反，見圖3和表5。說明下調(diào)miR-338-3p逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA ITGB2-AS1對A549/DTX細胞增殖、凋亡和多西他賽耐藥性的作用。

表5 lncRNA ITGB2-AS1調(diào)控miR-338-3p的表達

圖3 下調(diào)miR-338-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA ITGB2-AS1對A549/DTX細胞多西他賽耐藥性的影響注：A.增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達；B.細胞凋亡流式圖

表5 下調(diào)miR-338-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA ITGB2-AS1對A549/DTX細胞多西他賽耐藥性的作用

3 討論

研究表明，lncRNA在肺癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤組織中出現(xiàn)差異表達，可能通過對多種靶點和途徑的失調(diào)導(dǎo)致耐藥的發(fā)生[7]。最近研究報道，lncRNA ITGB2-AS1在乳腺癌細胞中被骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(BMP9)下調(diào)，其可通過上調(diào)ITGB2促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲[8]。lncRNA ITGB2-AS1在胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)中表達上調(diào)，可能是PDAC的診斷生物標志物[9]，在體內(nèi)敲低其表達，可靶向miR-4319/RAF1軸抑制PDAC細胞的增殖、遷移侵襲，促進細胞凋亡[3]。還有研究通過采用加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)方法構(gòu)建共表達基因模塊，發(fā)現(xiàn)lncRNA ITGB2-AS1與與卵巢癌患者的總生存率顯著相關(guān)[10]，但其在肺癌中的表達情況和作用尚不清楚。本研究通過建立肺癌多西他賽耐藥細胞系A(chǔ)549/DTX，檢測不同濃度(6.25 μg/L、12.5 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L)的DTX對肺癌A549和A549/DTX細胞的抑制率和IC50，發(fā)現(xiàn)DTX對A549/DTX的抑制率顯著低于A549細胞，IC50高于A549細胞，lncRNA ITGB2-AS1在A549/DTX細胞中表達顯著上調(diào)，與其他研究者的結(jié)論[3-4,9]類似，在A549/DTX細胞中轉(zhuǎn)染si-ITGB2-AS1聯(lián)合DTX處理可促進A549/DTX細胞的抑制率及細胞凋亡，上調(diào)p21和Bax含量，下調(diào)CyclinD1和Bcl-2蛋白含量，說明lncRNA ITGB2-AS1可能是肺癌潛在的化療增敏靶點。

本研究通過LncBase v.2預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p與lncRNA ITGB2-AS1存在結(jié)合位點。miR-338-3p在多種癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，在前列腺癌[11]、乳腺癌[12]、胃癌[13]和結(jié)直腸癌[14]中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可靶向不同的基因抑制癌細胞的增殖和進展。miR-338-3p在高轉(zhuǎn)移非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株和臨床轉(zhuǎn)移組織中顯著下調(diào)，其通過靶向參與EMT過程的Sox4，在體內(nèi)外均能抑制NSCLC細胞的遷移和侵襲[15]。miR-338-3p也可通過靶向鞘氨醇激酶2(SphK2)或胰島素受體底物2(IRS2)在NSCLC中發(fā)揮抑癌作用[16-17]。miR-338-3p還可通過下調(diào)WNT2B，增強卵巢癌細胞對順鉑的敏感性[18]，通過靶向缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)，抑制肝癌細胞并增強其對索拉非尼敏感性[19]。上述研究均表明miR-338-3p與腫瘤細胞的進展及耐藥性有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p在A549/DTX中含量顯著低于A549細胞，與Li等人[15]的研究結(jié)論類似。雙熒光素酶報告實驗和qRT-PCR結(jié)果表明，lncRNA ITGB2-AS1靶向負調(diào)控miR-338-3p的表達；進一步實驗還發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-338-3p可逆轉(zhuǎn)抑制lncRNA ITGB2-AS1對A549/DTX細胞增殖、凋亡和多西他賽耐藥性的作用，驗證了在肺癌中兩者之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。

本研究闡述了與肺癌A549細胞相比，在肺癌DTX耐藥細胞A549/DTX中，lncRNA ITGB2-AS1表達上調(diào)，miR-338-3p表達下調(diào)，lncRNA ITGB2-AS1靶向miR-338-3p調(diào)控A549/DTX細胞增殖、凋亡和多西他賽耐藥性。LncRNA ITGB2-AS1可能是肺癌潛在的化療增敏靶點。