藍曉慶，韋瑀龍，陸蘭娟

0 引言

跌打酒是廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由制馬錢子、大黃、三七、續(xù)斷、乳香、沒藥、蘇木、澤蘭、土鱉蟲、自然銅、無名異等十多味中藥所組成，具有活血止痛，通絡化瘀的功效，臨床觀察研究表明[1-3]，該藥用于跌打損傷，關節(jié)疼痛，四肢麻木等癥療效顯著。方中馬錢子通絡止痛，散結消腫，具有鎮(zhèn)痛、促進骨折愈合、修復軟骨損傷和抗骨質增生的藥理作用[4]；大黃涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，《神農(nóng)本草經(jīng)》有言：本品主下瘀血、血閉、寒熱、破癥瘕積聚；三七散瘀止血，消腫定痛，以上三者均為跌打損傷的常用要藥。

本研究嘗試采用液質聯(lián)用色譜法在同一色譜質譜條件下測定跌打酒中來源于馬錢子(馬錢子堿和士的寧)、大黃(大黃酸、大黃酚、大黃素和大黃素甲醚)和三七(三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1)的9種成分，并進行主成分分析，經(jīng)查閱文獻未見有上述9個成分同時測定方法的報道，本方法的開發(fā)建立可為跌打酒或類似制劑的質量控制和評價提供參考。

1 儀器與試藥

超聲波清洗機(VGT-2227QTD，廣東固特超聲股份有限公司)，電子分析天平(GR-202，日本)，高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀(LC-MS TripleQuad 3500)；馬錢子堿(批號：MUST-17041906)、士的寧(批號：MUST-17053001)對照品購于成都曼思特生物科技有限公司；大黃酸(批號：0757-200206)、大黃酚(批號：110796-200412)、大黃素(批號：110756-200110)、大黃素甲醚(批號：110704-200420)、三七皂苷R1(批號：110745-200415)、人參皂苷Rb1(批號：110704-200420)、人參皂苷Rg1(批號：110703-201731)對照品購于中國食品藥品檢定研究院，甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件 色譜條件：色譜柱kinetex C18(50 mm × 3 mm，2.6 μm)；流動相為0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～1.0 min,90.0%A;1.0～1.5 min,90.0%～80.0%A;1.5～5.0 min,80.0%～55.0%A;5.0～7.0 min,55.0%～8.0%A;7.0～9.0 min,8.0%A;9.0～9.1 min,8.0%～90.0%A;9.1～11.0 min,90.0%A)；流速0.35 ml/min，柱溫35 ℃；進樣量10 μl。質譜條件：離子源為ESI；檢測模式：正、負離子模式；掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：500.0 ℃。質譜參數(shù)見表1。

表1 9種成分的質譜參數(shù)[5-7]

圖1 9種成分的提取離子流色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 精密稱取馬錢子堿、士的寧、大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對照品適量，分別置10 ml量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，分別得到濃度為1.0 mg/ml的對照品貯備液。再分別精密量取對照品貯備液適量，以甲醇依次稀釋成濃度為100 μg/ml，10 μg/ml，1 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2 精密吸取馬錢子堿、士的寧、三七皂苷R1對照品溶液適量至25 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得含馬錢子堿、士的寧、三七皂苷R1均為1 μg/ml的混合對照品溶液A。

2.2.3 精密吸取大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對照品溶液適量至25 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得含大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1均為1 μg/ml的混合對照品溶液B。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚供試品溶液 精密量取跌打酒1.0 ml，至50 ml量瓶中，加甲醇-水(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 馬錢子堿、士的寧、三七皂苷R1供試品溶液 精密量取“2.3.1”項的供試品溶液10.0 ml，至50 ml量瓶中，加甲醇-水(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1供試品溶液 精密量取“2.3.1”項的供試品溶液1.0 ml，至50 ml量瓶中，加甲醇-水(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 線性關系 精密吸取混合對照品溶液A適量，甲醇-水(1∶1)稀釋成對照品濃度為80、100、150、200、400、600、800 ng/ml系列梯度，在“2.1”項下條件下進樣測定；精密吸取混合對照品溶液B適量，甲醇-水(1∶1)稀釋成對照品濃度為20、50、80、100、150、200、400 ng/ml系列梯度，在“2.1”項下條件下進樣測定。上述測定結果以濃度(ng/ml)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸，結果見表2。

表2 各成分的線性回歸方程

2.5 重復性試驗 取同一批樣品，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，進樣，測峰面積，結果見表3。

2.6 精密度試驗 取混合對照品溶液A、B，分別連續(xù)進樣6次，測定峰面積，結果見表3。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12 h進樣，測定峰面積，結果見表3。

表3 重復性、精密度、穩(wěn)定性試驗結果

結果表明，測定方法的重復性和儀器精密度良好，且供試品溶液在12 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.8 加樣回收率試驗 精密吸取同一已知含量的樣品0.5 ml，按表4供試品溶液制備方法分別制備各成分加樣回收試驗用供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣測定，計算回收率及RSD值，結果見表5。

表4 加樣回收供試液制備

表5 加樣回收試驗結果

2.9 樣品測定

取10批跌打酒樣品，按“2.3”項下方法分別平行制備供試品2份，在“2.1”項下條件進樣測定，計算各成分含量，結果見表6。

表6 10批樣品的測定結果(μg/ml)

2.10 主成分分析 以SPSS 19.0 對上述測定的9個成分進行主成分分析，計算其特征值和方差貢獻率，以特征值>1為標準，得出前三個主成分因子特征值分別為4.125、2.435、1.280，是評價跌打酒質量的主要影響因子，三個主成分因子的方差貢獻率為87.106%，結果見表7。

表7 主成分因子的特征值及方差貢獻率

表8 旋轉后的主因子載荷矩陣表

表9 10批樣品的主成分因子綜合得分及排序

3 討論

中藥制劑尤其是復方制劑成分復雜，采用單一成分的含量評價制劑質量有所欠缺，而采用高效液相色譜法測定多個成分雖較易于普及，但耗時較長，且部分成分因結構性質差異較大，在同一色譜條件下的分離度不甚理想，而液質聯(lián)用色譜法能進一步通過提取相應成分的特征離子流，所以其定性與定量受樣品色譜分離度的影響不大。

前期試驗考察以0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動相，人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1色譜峰響應低、干擾大，改成0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇后，不僅能有效改善人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1色譜行為，同時不影響其他成分的檢測。

從主成分分析結果來看，測定的10批樣品中，前期生產(chǎn)的6個批次中部分成分含量的批間波動較大，而后期生產(chǎn)的4個批次(即20171121、20180228、20180825、20190114)批間成分含量差異小，且整體質量更好，這可能與近年來國家加強對中藥飲片的監(jiān)管有關，使得購進的原料質量有所保障，進而保證了產(chǎn)品質量。