馬鳳嬌，田國亮，郭高生，陳 雷

0 引言

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的高發(fā)病率、高死亡率的癌癥類型[1]。晚期肝癌患者的手術(shù)和非手術(shù)治療都不能取得令人滿意的結(jié)果，目前開發(fā)的針對(duì)肝癌患者的靶向藥物也只有索拉非尼(Sorafenib)和雷戈拉非尼(Regorafenib)能夠成功延長(zhǎng)肝癌患者的生存時(shí)間[2-3]。索拉非尼是首批用于晚期肝癌患者全身治療的靶向藥物[2-3]，隨后的研究也證實(shí)了索拉非尼在臨床應(yīng)用中的有效性[4]。

目前的研究認(rèn)為，索拉非尼是細(xì)胞鐵死亡(Ferroptosis)的特異性誘導(dǎo)劑[5-6]。鐵死亡是一種不同于細(xì)胞凋亡、壞死和自噬的依賴于脂質(zhì)過氧化程度增加的細(xì)胞死亡方式[7]。細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生機(jī)制如下：①細(xì)胞內(nèi)鐵的聚集；②谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的耗竭以及下游蛋白谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4，GPX4)的失活；③鐵死亡抑制蛋白1(Ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)和輔酶Q10的相互作用。以上途徑都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧(Lipid Reactive oxygen species,Lipid ROS)含量的增加，進(jìn)而導(dǎo)致鐵死亡的進(jìn)程。Fer-1是鐵死亡的特異性抑制劑，能夠有效降低細(xì)胞內(nèi)的Lipid ROS含量，抑制鐵死亡的發(fā)生[8-12]。

Haloperidol是一種σ-1受體(Sigma-1 receptor，S1R)拮抗劑。S1R是一種非阿片樣蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、胰腺和癌細(xì)胞都有廣泛表達(dá)[13]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，S1R可能通過激活抗氧化相關(guān)因子并減少氧化的GSH和谷氨酸來減少ROS的產(chǎn)生[14-15]。也有研究發(fā)現(xiàn)，S1R通過調(diào)節(jié)NRF2-Keap1途徑和胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)xCT(Cystine/glutamate antiporter,xCT)來調(diào)節(jié)Lipid ROS含量，進(jìn)而在鐵死亡中發(fā)揮作用[13]。

在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)S1R拮抗劑haloperidol可以通過調(diào)節(jié)GSH和GPX4，進(jìn)而增強(qiáng)索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞的抗癌作用。我們的研究進(jìn)一步確認(rèn)了S1R和細(xì)胞鐵死亡之間的的聯(lián)系，為肝癌的治療提供了一個(gè)新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及材料 精密電子天平(Sartorius 德國)；Eppendorf 離心機(jī)(Eppendorf公司,德國)；振蕩渦旋器(科爾德實(shí)驗(yàn)儀器廠,中國)；雙向磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司,中國)；pH計(jì)(MeterToledoGmbH公司,德國)；細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning,美國)；PCR八連排(Axygen,美國)；Olympus BX60顯微鏡(奧林巴斯公司 日本)；恒溫CO2培養(yǎng)箱(Heraeus type B 5060 EK/CO2,美國)；超凈工作臺(tái)(北京市昌平長(zhǎng)城空氣凈化設(shè)備公司生產(chǎn),中國)；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,中國)；微量加樣器(Eppendorf公司,德國)；NANODROP 1000分光光度計(jì)(Thermo SCIENTIFI,美國)；冰箱(青島海爾公司,中國)；Mx3000PTM 實(shí)時(shí)定量PCR儀(Stratagene公司,美國)；恒溫水浴箱(上?？爝M(jìn)醫(yī)療器械廠,中國)；醫(yī)用微波爐(廣東美的集團(tuán),中國)；通用電源(Bio-rad,美國)。GPX4(ab125066,Abcam公司)；S1R(sc137075,Santa Cruz公司)；sorafenib(No.S7397,Selleck公司)；Fer-1(No.S7243,Selleck公司)；haloperidol(No.S7743,Selleck公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株和引物 肝癌細(xì)胞株HepG2，Huh-7，SMMC-7721和PLC/PRF/5細(xì)胞購自中國科學(xué)院(中國上海)。這些細(xì)胞培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清(HyClone)以及100 U / ml青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液(HepG2，Huh-7和PLC/PRF/ 5)或RPMI 1640培養(yǎng)基(SMMC-7721)中。生工生物技術(shù)公司(上海)合成引物，見表1。

表1 合成物引物

1.2.2 RT-qPCR分析 用TRIzol試劑進(jìn)行總RNA(Invitrogen)提取。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO)進(jìn)行cDNA合成，按照說明書進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)(TaKaRa)。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)(2-ΔΔCT)計(jì)算每對(duì)樣本的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Western-blot分析 用RIPA試劑(碧云天)進(jìn)行蛋白提取。采用BCA法蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。利用10%的SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，150 mA濕轉(zhuǎn)90 min，利用5%脫脂牛奶室溫封閉60 min。一抗4℃孵育過夜，1XTBST洗3次后，二抗室溫孵育1 h，1XTBST再次洗膜。最后，用ECL 化學(xué)發(fā)光液(Invitrogen)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行觀察，在Image J上對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法進(jìn)行細(xì)胞活性分析。96孔板中加入104細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁后按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行給藥處理，處理24 h后加入CCK-8染料。用酶標(biāo)儀在520 nm處進(jìn)行吸光值測(cè)量。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 利用結(jié)晶紫染色進(jìn)行細(xì)胞活性分析。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行給藥處理細(xì)胞24 h，經(jīng)胰蛋白酶消化后，以低細(xì)胞密度接種，溫育1～3 周，固定染色并計(jì)集落數(shù)。

1.2.6 GSH含量測(cè)定 使用GSH分析試劑盒(索萊寶)對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSH的含量進(jìn)行測(cè)量。離心收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液收集蛋白上清置冰上待測(cè)，按照說明書依次加入試劑進(jìn)行反應(yīng)，最后用酶標(biāo)儀在412 nm處進(jìn)行吸光值測(cè)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)資料類型，計(jì)量資料采用單因素方差分析，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 索非拉尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡 為了確認(rèn)索非拉尼對(duì)肝癌細(xì)胞的影響，我們構(gòu)建了索非拉尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的體外模型。首先，向肝癌細(xì)胞HepG2(圖1A)，Huh-7(圖1B)，SMMC-7721(圖1C)和PLC/PRF/5(圖1D)細(xì)胞中添加不同濃度的索非拉尼處理24 h，利用CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與DMSO組相比，不同濃度的索非拉尼都能顯著降低肝癌細(xì)胞的活性，并且隨著索非拉尼濃度的增加，細(xì)胞的活性逐漸降低；由于5 μM索非拉尼在這四種細(xì)胞株中都能顯著降低細(xì)胞活性并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A-D;P<0.001)，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用5 μM索非拉尼進(jìn)行。為了進(jìn)一步驗(yàn)證索非拉尼誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是鐵死亡，向培養(yǎng)基中同時(shí)添加5 μM索非拉尼以及鐵死亡的特異性抑制劑Fer-1，F(xiàn)er-1能夠有效抑制索非拉尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡(圖1A-D;P<0.001)。這些結(jié)果表明，索非拉尼能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，進(jìn)而降低其活性。

圖1 索非拉尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡注：(A-D)索非拉尼處理HepG2(A)，Huh-7(B)，SMMC-7721(C)和PLC/ PRF/5(D)細(xì)胞24 h，利用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞活性分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，***P<0.001 vs. DMSO，## P<0.01；###P<0.001 vs.5 μM索非拉尼

2.2 索非拉尼誘導(dǎo)S1R表達(dá) 向肝癌細(xì)胞HepG2(圖2A)，Huh-7(圖2B)，SMMC-7721(圖2C)和PLC/PRF/5(圖2D)細(xì)胞中添加不同濃度的索非拉尼處理24 h，利用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)及Western-blot實(shí)驗(yàn)對(duì)S1R的變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與DMSO組相比，不同濃度的索非拉尼都能顯著增加肝癌細(xì)胞中S1R的mRNA水平，并且隨著索非拉尼濃度的增加，細(xì)胞S1R的mRNA水平逐漸增加(圖2A-D;P<0.001)；同時(shí)，Western-blot實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)S1R水平也能被索非拉尼提高(圖2E;P<0.001)。這些結(jié)果表明,索非拉尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡后，細(xì)胞內(nèi)存在保護(hù)性升高的S1R水平。

圖2 索非拉尼誘導(dǎo)S1R表達(dá)注：(A-D)索非拉尼處理HepG2(A)，Huh-7(B)，SMMC-7721(C)和PLC / PRF / 5(D)細(xì)胞24 h，利用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)對(duì)S1R的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。(E)索非拉尼處理HepG2細(xì)胞24 h，利用Western-blot實(shí)驗(yàn)對(duì)S1R的蛋白水平進(jìn)行檢測(cè) 數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，***P<0.001 vs.DMSO

2.3 Haloperidol可以促進(jìn)索拉非尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞鐵死亡 向肝癌細(xì)胞HepG2(圖3A)、Huh-7(圖3B)、SMMC-7721(圖3C)和PLC/PRF/5(圖3D)細(xì)胞中同時(shí)添加索非拉尼和S1R的拮抗劑haloperidol處理24 h，利用CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與索非拉尼組相比，索非拉尼+haloperidol組的肝癌細(xì)胞的活性進(jìn)一步降低并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A-D，P<0.001)；并且同時(shí)添加索非拉尼和haloperidol導(dǎo)致的肝癌細(xì)胞死亡也能夠被鐵死亡的特異性抑制劑Fer-1抑制(圖3A-D，P<0.001)，這表明haloperidol促進(jìn)肝癌細(xì)胞的鐵死亡進(jìn)程?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，索非拉尼+haloperidol組的肝癌細(xì)胞克隆數(shù)比單獨(dú)添加索非拉尼組更低(圖3E，P<0.001)。

圖3 Haloperidol可以增敏索拉非尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞鐵死亡注：(A-D)索非拉尼和haloperidol處理HepG2(A)，Huh-7(B)，SMMC-7721(C)和PLC/PRF/5(D)細(xì)胞24 h，利用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞活性分析。(E)索非拉尼和haloperidol處理HepG2細(xì)胞24 h，利用克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞活性分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，***P<0.001 vs.DMSO，## P<0.01；###P<0.001 vs.5 μM索非拉尼

2.4 Haloperidol可以降低鐵死亡進(jìn)程中的GSH及GPX4 同時(shí)添加索非拉尼和haloperidol處理肝癌細(xì)胞24 h，利用GSH含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)以及Western-blot實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的GSH含量及GPX4水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與索非拉尼組相比，索非拉尼+haloperidol組HepG2(圖4A)、Huh-7(圖4B)、SMMC-7721(圖4C)和PLC/PRF/5(圖4D)細(xì)胞中GSH含量進(jìn)一步降低并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A-D，P<0.001)；并且同時(shí)添加索非拉尼和haloperidol也會(huì)導(dǎo)致GPX4蛋白水平的進(jìn)一步降低(圖4E，P<0.001)。

圖4 Haloperidol可以降低鐵死亡進(jìn)程中的GSH及GPX4注：(A-D)索非拉尼和haloperidol處理HepG2(A)，Huh-7(B)，SMMC-7721(C)和PLC / PRF / 5(D)細(xì)胞24 h，利用GSH試劑盒對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSH的含量進(jìn)行檢測(cè)。(E)索非拉尼和haloperidol處理HepG2細(xì)胞24 h，利用Western-blot實(shí)驗(yàn)試劑盒對(duì)細(xì)胞內(nèi)GPX4的蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，***P<0.001 vs.DMSO，## P<0.01；###P<0.001 vs.5 μM索非拉尼。

3 討論

索拉非尼是一種新型多靶向性的治療腫瘤的口服藥物,能選擇性地靶向某些在腫瘤生長(zhǎng)過程中發(fā)揮作用的受體。索拉非尼是鐵死亡的誘導(dǎo)劑之一，之前的研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡不受細(xì)胞內(nèi)致癌基因狀態(tài)的影響[16]，它能夠直接結(jié)合GPX4并使其失活，而不會(huì)影響GSH的水平[17]。目前的大部分研究都發(fā)現(xiàn),GPX4是鐵死亡進(jìn)程中的核心靶點(diǎn)[9,18]。

目前大部分研究都通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧的積累和鐵代謝來調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡進(jìn)程。同時(shí)，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)GSH濃度也可保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響進(jìn)而抑制鐵死亡進(jìn)程。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)S1R是人類肝癌細(xì)胞中鐵死亡的負(fù)向調(diào)節(jié)劑，它可以調(diào)節(jié)鐵死亡中關(guān)鍵分子的表達(dá)，如GSH 以及GPX4等。

Haloperidol是一種治療精神/情緒障礙的S1R拮抗劑，之前關(guān)于S1R的研究主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)[19-24]。在癌細(xì)胞中，索拉非尼可以誘導(dǎo)S1R蛋白表達(dá)，從而保護(hù)細(xì)胞免于ROS的積累和隨后的肥大癥。因此，S1R可能在肝細(xì)胞癌中起雙重作用。一方面，S1R保持自由基和氧化應(yīng)激的穩(wěn)定環(huán)境，進(jìn)而阻止了肝細(xì)胞癌的發(fā)生。另一方面，索拉非尼可以上調(diào)S1R，以保護(hù)癌細(xì)胞免于肥大癥。我們的研究發(fā)現(xiàn)，haloperidol處理后，GSH及GPX4表達(dá)進(jìn)一步降低，這明S1R可能是GSH及GPX4的上游調(diào)控因子。我們?cè)诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中也會(huì)對(duì)S1R和GSH及GPX4之間的具體機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討。利用S1R拮抗劑haloperi-dol可以加快索拉非尼導(dǎo)致肝癌細(xì)胞鐵死亡的進(jìn)程。

在這項(xiàng)研究中，我們首次證明haloperidol可以加快索拉非尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞鐵死亡進(jìn)程。haloperidol通過抑制S1R調(diào)節(jié)GSH及GPX4的表達(dá),從而提高索拉非尼的抗癌作用。因此，更好地了解S1R的作用會(huì)為鐵死亡的生化機(jī)制提供新的見解。我們后續(xù)也會(huì)進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來探索S1R和GSH及GPX4之間的具體作用機(jī)制。