文/葉紅梅 李慧

天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站在2017年～2019年3年間使用恒溫?zé)晒夥焖僭噭┖?，?duì)本市養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦9個(gè)區(qū)的養(yǎng)殖企業(yè)及養(yǎng)殖戶送檢與抽檢的種蝦、蝦苗、養(yǎng)殖過(guò)程中不同階段的蝦，進(jìn)行了6種流行病病原指標(biāo)檢測(cè)。恒溫?zé)晒夥?zhǔn)確率高，可有效縮短檢測(cè)時(shí)間，在病害防治中能起到關(guān)鍵作用，有效推動(dòng)當(dāng)?shù)厮a(chǎn)養(yǎng)殖綠色健康發(fā)展。

近年來(lái)，南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖已成為天津市水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)，但由于蝦苗質(zhì)量參差不齊、養(yǎng)殖密度高、飼料品質(zhì)低及投喂不當(dāng)?shù)纫蛩?，造成?duì)蝦養(yǎng)殖病害不斷發(fā)生，給企業(yè)及養(yǎng)殖戶造成不小的損失。在整個(gè)養(yǎng)殖周期中，買到優(yōu)質(zhì)健康的蝦苗、保持穩(wěn)定的水環(huán)境及蝦病防控已成為南美白對(duì)蝦健康養(yǎng)殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

針對(duì)當(dāng)?shù)啬厦腊讓?duì)蝦養(yǎng)殖中常見(jiàn)發(fā)病情況，確定出流行病原監(jiān)測(cè)指標(biāo)6項(xiàng)，其中病毒指標(biāo)4項(xiàng)：對(duì)蝦白斑綜合征（White spot syndrome virus，WSSV）、傳染性皮下及造血組織壞死病（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）、對(duì)蝦偷死?。–overt mortality nodavirus，CMNV）和蝦血細(xì)胞虹彩病毒?。⊿hrimp hemocyte iridescent virus，SHIN）（2019年新增檢測(cè)指標(biāo)）；細(xì)菌類指標(biāo)1項(xiàng)：急性肝胰腺壞死?。╝cute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）/早期死亡綜合征（EMS）；寄生蟲類指標(biāo)1項(xiàng)：蝦肝腸胞蟲?。‥nterocytozoon hepatopenaei，EHP）。

一、快速試劑盒法（恒溫?zé)晒夥ǎ?/h2>

筆者單位對(duì)南美白對(duì)蝦六種流行病原指標(biāo)檢測(cè)采用了快速試劑盒法。快速試劑盒法（恒溫?zé)晒夥ǎ┎≡瓩z測(cè)包括核酸提取和檢測(cè)，提取和檢測(cè)分別按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用試劑盒為廣州迪澳生物科技有限公司生產(chǎn)，用水產(chǎn)動(dòng)物病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取的核酸可用于上述4種病毒檢測(cè)，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取的核酸可用于細(xì)菌AHPND/EMS和寄生蟲EHP檢測(cè)。

（一）試劑盒保存條件及保質(zhì)期

1.提取試劑盒

水生動(dòng)物病毒基因組D N A/R N A 提取試劑盒組份可在室溫下（15℃～25℃）干燥保存12個(gè)月，長(zhǎng)期保存時(shí)要置于2℃～8℃的環(huán)境中。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒中蛋白酶K（Proteinase k）干粉和溶菌酶（Lysozyme）干粉需要保存在-20℃的環(huán)境中，其余試劑可在室溫下（15℃～25℃）干燥保存12個(gè)月，長(zhǎng)期保存時(shí)應(yīng)置于2℃～8℃的環(huán)境中。

2.檢測(cè)試劑盒

恒溫?zé)晒夥ê怂釞z測(cè)試劑盒保存溫度在-18℃～-25℃，有條件的可-80℃低溫保存，有效期為12個(gè)月。

（二）檢測(cè)樣品的制備

核酸檢測(cè)試劑盒法（恒溫?zé)晒夥ǎz測(cè)要全程在衛(wèi)生潔凈的環(huán)境中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)需要使用的工具如剪刀、鑷子、紗布、生理鹽水等要經(jīng)過(guò)滅菌處理，槍頭、離心管要無(wú)菌成品。實(shí)驗(yàn)時(shí)實(shí)驗(yàn)人員全程穿工作服，戴一次性手套。實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，沒(méi)有生物安全柜的可劃定專門區(qū)域，保證該區(qū)域干凈整潔無(wú)污染。實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的所有廢棄物需進(jìn)行無(wú)害化處理。

1.鮮活的蝦樣：將從池塘中打撈的蝦放入干凈的塑料袋中或塑料瓶中，放入一定的養(yǎng)殖水，有條件的可以在袋內(nèi)充氧，保證運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室的蝦為活體。用多層紗布濾掉蝦體水分后將其放入干凈的塑料袋或離心管中，編號(hào)備檢。大一點(diǎn)的蝦用剪刀剪去眼柄后，取包含肝胰腺組織的蝦頭部分進(jìn)行檢測(cè)，不能馬上檢測(cè)的要放入低溫冰箱中保存。

2.瀕臨死亡的病蝦：對(duì)于在池塘中已有發(fā)病癥狀但不能馬上拿到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的蝦，養(yǎng)殖戶可將其打撈后放到干凈的礦泉水瓶或塑料袋中低溫冷凍保存，做好標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)前將其解凍，剪去眼柄后蝦頭留待檢測(cè)。

（三）蝦樣基因的提取

提取過(guò)程要在環(huán)境整潔、器皿潔凈下進(jìn)行。因使用試劑純度較高，試驗(yàn)人員操作要準(zhǔn)確。

1.水生動(dòng)物病毒基因組（DNA/RNA）的提取：將制備的蝦樣按照所購(gòu)試劑公司試驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行提取。病毒基因組提取后的DNA/RNA如暫時(shí)不檢測(cè)要放入低溫冰箱中-80℃保存，一周內(nèi)盡快檢測(cè)。另外因?yàn)樘崛『蟮牟《净蚪M核酸溶液要做4項(xiàng)病毒檢測(cè)，因此加入的DEPC水要取50μL以保證足夠的提取量。

2.細(xì)菌基因（DNA）提?。喊凑照f(shuō)明書操作規(guī)程進(jìn)行提取。不同于病毒基因提取的是其消化時(shí)間較長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)碎化處理的蝦樣加入緩沖物（Buffei STE和 SDS）及蛋白酶K后，一般水浴3小時(shí)消化完全。提取的DNA保存于2℃～8℃，長(zhǎng)期保存需低于-20℃。

（四）檢測(cè)

以提取的DNA作為模板，加入核酸檢測(cè)試劑盒中的反應(yīng)液、聚合酶、密封液后，分別進(jìn)行WSSV、IHHNV、AHPND/EMS、EHP特異性PCR檢測(cè)，并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。檢測(cè)“對(duì)蝦血細(xì)胞虹彩病毒”及“對(duì)蝦偷死野田村病毒”2種病毒時(shí)需要在提取的DNA模板中加入逆轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA后再進(jìn)行上述操作。檢測(cè)儀器采用恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀。

檢測(cè)原理是采用恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，通過(guò)聚合酶及特異性引物在恒溫條件下對(duì)病原核酸片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物（DNA）與核酸染料結(jié)合后發(fā)出熒光信號(hào)，根據(jù)所產(chǎn)生的擴(kuò)增曲線判斷結(jié)果。

需要特別注意是太陽(yáng)光不能直射檢測(cè)機(jī)器，防止強(qiáng)光下儀器將陰性樣品檢測(cè)出假陽(yáng)性?？衫洗昂熥稣诠馓幚?。

各病原指標(biāo)上機(jī)檢測(cè)所需體積及擴(kuò)增溫度、反應(yīng)時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 病原指標(biāo)上機(jī)檢測(cè)所需各種試液體積及擴(kuò)增溫度、反應(yīng)時(shí)間

除蝦血細(xì)胞虹彩病毒（SHIV）和蝦肝腸胞蟲（EHP）反應(yīng)時(shí)間為45分鐘，其余4項(xiàng)指標(biāo)反應(yīng)時(shí)間為60分鐘。

二、檢測(cè)結(jié)果與討論

筆者3年間共檢測(cè)南美白對(duì)蝦蝦樣401個(gè)，包括蝦苗及養(yǎng)殖中不同階段的蝦。

（一）年度陽(yáng)性樣品檢出率為：

2017年為IHHNV>AHPND/EMS>EHP>WSSV>CMNV，IHHNV陽(yáng)性檢出率最高；2018年為EHP>IHHNV>AHPND/EMS>CMNV>WSSV，EHP檢出率最高；2019年為HP>AHPND/EMS>CMNV>IHHNV>WSSV，EHP檢出率最高。2018年、2019年蝦肝腸胞蟲（EHP）檢出率高，說(shuō)明種蝦本身攜帶EHP病原，孵化時(shí)垂直傳播給蝦苗或孵化池消毒不徹底水體中病毒水平傳播給蝦苗。

（二）3年間陽(yáng)性樣品檢出率

1.WSSV：17.8%（2017年）>16.3%（2019年）>15.1%（2018年），3年內(nèi)都有檢出，但變化不大；

2.IHHNV：49.5%（2017年）>25.6%（2018年）>18.3%（2019年），3年內(nèi)呈逐年下降的趨勢(shì)；

3.CMNV：15.0%（2017年）＜17.4%（2018年）＜25.5%（2019年），3年內(nèi)呈逐年上升的趨勢(shì)。

4.SHIV：2019才開(kāi)始檢測(cè)SHIV。因?yàn)橹粰z測(cè)34個(gè)樣品，顯示陽(yáng)性樣品4個(gè)，檢出率11.8%。出現(xiàn)的陽(yáng)性樣品是同一家單位且同一個(gè)池塘的2種蝦樣（小龍蝦和南美白對(duì)蝦），經(jīng)過(guò)復(fù)檢仍為陽(yáng)性，說(shuō)明此病毒出現(xiàn)幾率少但可以水平傳播；

5.AHPND/EMS：32.7%（2017年）>24.4%（2018年）>22.6%（2019年），3年內(nèi)呈逐年下降的趨勢(shì)；

6.EHP：19.6%（2017年）＜30.2%（2018年）＜30.8%（2019年），3年內(nèi)呈逐年上升的趨勢(shì)。

對(duì)蝦偷死?。–MNV）和蝦肝腸胞蟲病（EHP）這2種病原陽(yáng)性檢出率呈上升趨勢(shì)，養(yǎng)殖企業(yè)和養(yǎng)殖戶今后應(yīng)密切注意。如養(yǎng)殖前期選苗應(yīng)注意EHP檢測(cè)結(jié)果，一旦檢出陽(yáng)性應(yīng)果斷棄用，避免前期投入人力物力，養(yǎng)殖后期經(jīng)濟(jì)效益低。我們?cè)跈z測(cè)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，被送檢的樣品大部分為蝦苗，這說(shuō)明養(yǎng)殖企業(yè)和養(yǎng)殖戶越來(lái)越重視養(yǎng)殖前蝦苗的選擇，同時(shí)也充分證明了蝦苗檢測(cè)的重要性。

三、結(jié)論

筆者經(jīng)過(guò)多年檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)證明，用快速試劑盒法檢測(cè)南美白對(duì)蝦流行病病原定性準(zhǔn)確，準(zhǔn)確率高。并且應(yīng)用此方法可縮短檢測(cè)時(shí)間，尤其在養(yǎng)殖初期選苗階段，在養(yǎng)殖企業(yè)及養(yǎng)殖戶送檢的蝦樣較多、選苗時(shí)間較短的情況下，檢測(cè)人員可在短時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果能夠及時(shí)反饋給養(yǎng)殖戶，使他們及時(shí)淘汰病苗、劣質(zhì)苗，避免產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)損失。另外在養(yǎng)殖后期由于檢測(cè)時(shí)間短，可幫助養(yǎng)殖戶及時(shí)判斷病蝦發(fā)病種類，為養(yǎng)殖戶做好病害防治起到關(guān)鍵作用。