陳曉藝，方 程，王 辛，趙 鑫

(大連工業(yè)大學 生物工程學院,遼寧 大連 116034)

0 引 言

分泌系統(tǒng)在細菌的生命活動中發(fā)揮著重要作用，細胞通過分泌系統(tǒng)從外界環(huán)境中攝取營養(yǎng)物質、進行細胞間的信號傳遞、分泌毒力(致病)因子以及抵御宿主免疫系統(tǒng)的攻擊等[1-3]。近幾十年來，人們對革蘭氏陰性菌的蛋白質分泌途徑進行了深入的研究，迄今共發(fā)現(xiàn)了9種不同類型的分泌系統(tǒng)，分別被命名為Ⅰ～Ⅸ型分泌系統(tǒng)。待分泌的物質通過貫穿細胞被膜的專一性通道被直接運送到胞外(T1SS、T3SS、T4SS、T6SS)，或先通過細胞內膜上的Sec通道從胞質被轉運至周質空間，再進一步跨細胞外膜被分泌至胞外(T2SS、T5SS、T7SS、T8SS、T9SS)[4-6]。

其中，T9SS是新近發(fā)現(xiàn)的一類蛋白分泌系統(tǒng)，最初也被稱為PorSS系統(tǒng)，僅在擬桿菌門的部分微生物中存在，具有較高的種屬特異性[6-8]。以T9SS為分泌系統(tǒng)的微生物主要是牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)和約氏黃桿菌(Flavobacteriumjohnsoniae)，前者是主要的牙周炎致病菌，后者則是一種常見的環(huán)境微生物，具有滑動運動的特征。目前已經(jīng)鑒定到很多通過T9SS轉運的蛋白質，它們在結構上具有一定的共性，除了具有N末端信號肽外，C末端還普遍存在一個保守結構域——CTD。CTD由大約80個氨基酸殘基組成，負責引導蛋白質跨越細胞外膜而被運送至胞外[9]。圍繞T9SS的結構、功能以及相關分泌蛋白的性質已展開了許多研究，取得了一定的進展。

1 T9SS的發(fā)現(xiàn)

T9SS最初在牙齦卟啉單胞菌P.gingivalis中被發(fā)現(xiàn)，該菌株屬于革蘭氏陰性菌，專性厭氧，是誘發(fā)牙周炎的主要病原菌之一[10]。P.gingivalis能夠向胞外大量分泌一系列牙齦蛋白酶，它們大部分吸附在細胞外膜的外表面上，少部分以游離狀態(tài)存在。這些蛋白酶能夠攻擊和破壞宿主的先天防御機制，是重要的毒力因子[10]。P.gingivalis在血瓊脂平板上培養(yǎng)時，由于亞鐵血紅素在細胞表面積累，菌落正常呈黑色，而這與細胞表面牙齦蛋白酶的蛋白水解活性及其與血凝素和血紅蛋白的結合能力密切相關[11]。自發(fā)突變產(chǎn)生的白色或淺褐色突變株，其細胞表面的蛋白酶活性均顯著下降[11]。因此，牙齦蛋白酶的胞外活性與P.gingivalis菌落顏色之間的正相關性成為研究菌株蛋白分泌途徑的有效篩選工具。

PorT(PG0751/PGN_0778)是第一個被成功鑒定的編碼牙齦蛋白酶分泌途徑中關鍵轉運蛋白的基因，它的缺失導致突變株的胞外牙齦蛋白酶活性顯著降低，大量的酶蛋白以沒有活性的酶原形式滯留在細胞周質空間中[12]。研究者們將含有PorT基因的牙齦卟啉單胞菌與不含有PorT基因的多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的蛋白質組/基因組進行了比對，從中篩選出除PorT外另外55個可能參與的基因。隨后，通過對這些基因進行同源基因突變實驗，最終確定了11個與牙齦蛋白酶跨細胞外膜轉運及激活過程相關的基因。由于以上基因編碼的蛋白質與其他已知分泌系統(tǒng)(T1SS-T8SS)的任何組分都沒有序列相似性，因此研究者們認定這是一個全新的分泌系統(tǒng)，并將其命名為PorSS分泌系統(tǒng)[7]，該系統(tǒng)各組分蛋白的命名大多以“Por”為前綴，以表示這些蛋白質在牙齦蛋白酶分泌過程中的重要作用，而后者則與細胞產(chǎn)卟啉類黑色素密切相關[13]。為了與已有分泌系統(tǒng)命名一致，后又將其更名為Ⅸ型分泌系統(tǒng)，即T9SS[9，14]。

隨著T9SS在擬桿菌門中的發(fā)現(xiàn)，越來越多研究表明，不僅是P.gingivalis，很多其他病原微生物如福賽斯坦納菌(Tannerellaforsythia)和鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer)等，同樣是利用這一系統(tǒng)向胞外分泌毒力因子或效應蛋白，從而具有入侵宿主細胞以及抵御宿主免疫系統(tǒng)攻擊的能力[15-18]。另一方面，以哈氏噬纖維菌(Cytophagahutchinsonii)和約氏黃桿菌(Flavobacteriumjohnsoniae)為代表的非病原環(huán)境微生物，也通過T9SS向胞外分泌幾丁質酶和纖維素酶，使細胞能夠利用幾丁質和纖維素等生物大分子作為營養(yǎng)物質。同時，這兩類微生物細胞都具有滑動運動的特性，而研究發(fā)現(xiàn)T9SS的核心組件本身也是重要的滑動蛋白編碼基因[7-8，19]。所以，對不同的擬桿菌門微生物而言，T9SS既可以是病原菌攻擊宿主細胞的有力武器，也可以是細胞運動以及從外界環(huán)境攝取營養(yǎng)物質的有效工具[20-21]。

2 T9SS的組成

T9SS本身是一個多蛋白復合體，以P.gingivalis的T9SS為例，目前已知至少由18個組分構成(PorT、Sov、PorK、PorL、PorM、PorN、PorP、PorQ、PorU、PorW、PorV、PorX、PorY、PorZ等)，整體結構跨越了細胞質、細胞內膜、周質空間和細胞外膜。實驗證實，敲除任何一個基因，都會導致突變株菌落呈白色，且分泌蛋白在周質空間非正常積累[22]。P.gingivalis的T9SS結構預測如圖1所示[23]。

在P.gingivalis的基因組中，porPKLMN這5個基因連續(xù)排列并且同時轉錄，但PorP蛋白的表達水平比其他4個蛋白要低很多，研究者推測可能有單獨的啟動子負責調控porKLMN這5個基因的轉錄[24]。PorK是嵌于細胞外膜上的一個脂蛋白，與PorN相連接，PorL和PorM兩個蛋白則位于細胞內膜上(圖1)。這5個蛋白共同組成了一個分子質量超過1 000 ku的復合體，構成了跨細胞膜的轉運通道[7]。同樣，在F.johnsoniae中，這4個蛋白在細胞滑動和代謝幾丁質的過程中也起著關鍵作用，重要的滑動黏附素SprB和RemA都是通過這一通道被分泌到胞外的[19]。在眾多T9SS的外膜組分中，PorK和PorN被認為是細胞分泌物質以及滑動運動最不可或缺的兩個蛋白。結構分析表明，二者均具有32～36個亞基組成的大型環(huán)狀結構，直徑50 nm，高度約7 nm，且環(huán)狀結構大部分位于外膜的周質空間一側。據(jù)推測，PorK或PorN的環(huán)狀結構至少有一部分參與組成了外膜上的運輸孔道[25]。

圖1 P.gingivalis的T9SS的結構預測Fig.1 Structural prediction of T9SS of P.gingivalis

根據(jù)現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)，大多數(shù)通過T9SS分泌的蛋白都是錨定在細胞外膜的表面，而非游離釋放到培養(yǎng)基中。在P.gingivalis中，分泌蛋白在一個轉肽酶的作用下切除C末端的部分肽段(轉運信號)，并與脂多糖A-LPS共價結合，進而被錨定在細胞外膜上，這個轉肽酶即PorU[26]。PorU與其他3個蛋白(PorV、PorQ和PorZ)一起共同構成了一個“附著復合體”，在分泌蛋白錨定到外膜的過程中起關鍵作用[27]。PorV和PorQ都是外膜上的內在蛋白，而PorU則通過PorV而被錨定在外膜上[28]。缺失PorU和PorZ基因的突變菌株，分泌蛋白會部分游離釋放到培養(yǎng)基中，且其C末端信號肽未被切除[26-27]，由此推測PorU和PorZ參與了分泌蛋白信號肽切除及與A-LPS的結合過程。PorU的主要功能是作為轉肽酶進行肽段的切除，而PorZ則主要通過識別脂多糖A-LPS的甘露糖重復單元，幫助分泌蛋白與A-LPS共價結合。同時，PorZ對PorU在外膜上的固定也起到了一定的作用。相反，缺失PorV和PorQ基因的P.gingivalis突變菌株，細胞表面則完全沒有錨定分泌蛋白[27]。實驗表明，PorV與PorU的功能有相似之處，也能夠錨定細胞分泌的蛋白，在敲除PorU的突變株中，分泌蛋白可通過PorV的作用而被錨定在細胞表面。

除蛋白外，T9SS還包含很多其他組分，但目前對它們的結構和功能研究報道相對較少。PorP雖然在基因組中與PorKLMN相連，但PorP的蛋白表達水平幾乎比另外4個蛋白低了20倍。盡管PorP在空間結構上與PorK等其他組分相連，但卻不是外膜上分泌通道的核心組成成分。在約氏黃桿菌F.johnsoniae中存在多個PorP的同源基因，SprF是其中之一。在基因組上，SprF與SprB相連，后者編碼一種滑動黏附蛋白。SprF對SprB的分泌表達至關重要，但SprF的敲除并不影響細胞的滑動性，說明細胞還存在其他PorP同源基因在調控滑動黏附蛋白的分泌表達[29]。PG1058也是P.gingivalis細胞T9SS的一個重要組分，它的發(fā)現(xiàn)相對較晚[22]。PG1058是一個脂蛋白，定位于細胞的周質空間，由TolB和肽聚糖結合模塊組成。與PorP類似，PG1058在F.johnsoniae及其他滑動細菌中也存在多個同源蛋白，推測可能參與了某些特定底物的分泌表達。PorT和Sov是最先被鑒定的兩個T9SS組分，但是它們的功能至今尚未得到解析。PorT、Sov和PorW都是P.gingivalis細胞T9SS的基本組成成分，在F.johnsoniae中，這3個基因的缺失會導致細胞不能正常分泌幾丁質酶，但不影響細胞的滑動性。

PorX和PorY兩個蛋白既是T9SS的組成成分，也是系統(tǒng)的調控因子。PorX是響應調控因子同源蛋白，PorY是組氨酸激酶感應蛋白[30]。敲除其中任何一個基因，都導致T9SS各組分表達下調，同時細胞的牙齦蛋白酶活性降低[7，31]。研究表明，PorY能夠自我磷酸化，并與PorX相互作用，使得后者也被磷酸化修飾。PorX在細胞質中與信號分子SigP結合，后者又進一步與T9SS各組分基因的啟動子區(qū)域結合[31]。由此，PorY感應來自周質空間的信號，并通過PorX和SigP級聯(lián)反應來上調T9SS各組分基因的表達。

3 T9SS的蛋白轉運機制

蛋白質通過T9SS分泌運輸?shù)倪^程可分為兩步。首先，分泌蛋白在其自身N端信號肽的引導下，通過細胞內膜上的Sec轉運通道被運送至周質空間；然后，信號肽被切除，蛋白質折疊成具有穩(wěn)定構象的結構。其次，蛋白質進一步在其CTD的引導下，通過細胞外膜上的易位子被轉運至胞外。已有研究結果表明，所有通過T9SS運送的蛋白質普遍具有保守的CTD結構域。以牙齦蛋白酶RgpB為例，去掉C末端72個氨基酸殘基的突變體蛋白只能在細胞周質空間中積聚，不能被分泌到胞外[9]。CTD的完整性對RgpB的分泌至關重要，即使僅僅缺失2個氨基酸殘基，或者其中保守氨基酸殘基發(fā)生突變，都直接導致蛋白質不能夠被正常分泌[15]。

與其他分泌系統(tǒng)相比，T9SS轉運蛋白質有其獨特的特點，即被轉運的蛋白質大多數(shù)都被錨定在細胞表面，只有少數(shù)以游離狀態(tài)分泌到培養(yǎng)基質中。實驗表明，錨定在外膜上的分泌蛋白，其分子質量通常比理論值大20 ku左右，這是由于蛋白質共價結合了一個脂多糖分子A-LPS[32]。A-LPS本身是鑲嵌在細胞外膜上的，從而使與之結合的蛋白質被錨定在了細胞表面。在電鏡下觀察P.gingivalis細胞，發(fā)現(xiàn)被錨定在細胞表面的牙齦蛋白酶形成了一層包裹著細胞的致密電子層[26]。A-LPS合成有缺陷的突變株細胞表面則沒有電子層包裹，細胞分泌的蛋白質均以游離態(tài)被釋放到培養(yǎng)基中[33]。A-LPS與分泌蛋白的結合機制目前尚未得到解析，推測這一過程主要是在PorU的作用下完成的。PorU具有轉肽酶功能，能夠切除分泌蛋白的CTD結構域，隨后將新生成的C末端與A-LPS通過一段連接肽結合起來，而這一模式與革蘭氏陽性菌細胞表面蛋白質與肽聚糖層的結合十分相似[34]。

4 T9SS轉運的典型蛋白

通過T9SS轉運的蛋白質，按照功能不同大致可分為兩類：一類是能夠分解復雜生物大分子的酶，包括蛋白酶、糖苷水解酶(主要是幾丁質酶和纖維素酶)、核酶和脂酶等；另外一類則主要是黏附素、血細胞凝集素以及一些富含亮氨酸的蛋白質等。

P.gingivalis產(chǎn)生的牙齦蛋白酶RgpA、RgpB和Kgp是研究相對深入的T9SS轉運蛋白。它們是細胞分泌的主要毒力因子，能夠結合肽段和血紅素，攝取血紅蛋白為細胞提供營養(yǎng)；同時，它們通過自身的吸附性以及異常調節(jié)宿主的免疫防御和炎癥響應系統(tǒng)，在細胞致病機理中也發(fā)揮著重要作用[35-36]。類似的，T.forsythia利用T9SS分泌一系列毒素因子，包括各種細胞表層蛋白、富含亮氨酸的重復蛋白以及一類被稱為KLIKK的蛋白酶等[17，37-38]。其中兩個重要的分泌蛋白TfsA和TfsB構成了細胞表面的S層。S層結構較為規(guī)則，在細胞表面形成了一層被膜，能夠幫助菌株黏附并入侵人牙齦上皮細胞，且能夠延遲人體免疫系統(tǒng)對細菌細胞的識別[39]。

C.hutchinsonii能夠高效降解結晶纖維素，且降解過程依賴于完整的活細胞。已有研究證實，該菌株利用T9SS向胞外分泌纖維素酶，并將酶蛋白錨定在細胞表面[20]。SprP是C.hutchinsonii細胞中發(fā)現(xiàn)的PorP(P.gingivalis)同源蛋白，基因敲除實驗表明，SprP基因缺失的突變株失去纖維素降解能力，且依賴于T9SS分泌的胞外蛋白CHU_3105含量也顯著降低；同時，突變株也喪失了在纖維素表面的滑動能力，推測可能與滑動蛋白SprB不能夠被正常分泌有關[20]。已知C.hutchinsonii基因組中有147個基因編碼的蛋白質含有CTD結構域，包括5個β-1，4-內切葡聚糖酶以及大量與纖維素和其他多糖結合和降解相關的蛋白質。C.hutchinsonii細胞能夠在纖維素表面滑動、與纖維素底物吸附以及降解結晶纖維素的過程均與T9SS轉運的蛋白質密切相關。

C.hutchinsonii的細胞外膜上存在許多纖維素酶組分，它們可能共同構成了一個蛋白復合體[40]。例如，蛋白CHU_3220的C末端具有保守的CTD結構域，定位在細胞外膜上，可與纖維素結合，是菌株降解結晶纖維素過程中不可或缺的一個酶組分。敲除CHU_3220基因后，突變株細胞表面的內切葡聚糖酶活性顯著降低，說明CHU_3220基因可能同時調控了其他內切葡聚糖酶的表達[40]。CHU_1276和CHU_1277也是兩個外膜蛋白，二者本身都不具有纖維素酶活性，但均參與調控多個纖維素酶基因的表達或者與維持細胞表面的纖維素酶活性密切相關[41-42]。Zhu等[43]系統(tǒng)研究了C.hutchinsonii的所有內切葡聚糖酶編碼基因及其編碼蛋白的細胞定位和活性，發(fā)現(xiàn)其中5個酶蛋白(Cel5A、Cel9A、Cel9B、Cel9D和Cel9E)是通過T9SS被分泌并錨定在細胞外膜上，它們負責將纖維素分解為小分子的纖維寡糖，繼而跨過細胞外膜被運送至周質空間，再進一步被定位于周質空間的兩個內切酶Cel5B和Cel9C分解，由此共同組成了一個完整的纖維素降解酶系。

F.johnsoniae與C.hutchinsonii同屬擬桿菌門，具有滑動運動能力，并且能夠降解幾丁質。研究表明，F(xiàn).johnsoniae利用T9SS向胞外分泌滑動黏附蛋白SprB和RemA，使菌體細胞能夠在固體表面滑動[19]。SprB蛋白的分子質量大小為669 ku，是一個高度序列重復的蛋白質，它從外膜開始形成向外的長絲狀，并沿細胞表面呈螺旋狀運動[44]。在F.johnsoniae細胞中還含有多個SprB同源蛋白，它們可能賦予細胞在不同固體表面滑動的能力。RemA的分子質量為152 ku，與SprB一樣呈螺旋狀運動。RemA蛋白中心含有一個凝集素結構域，能夠結合細胞自身分泌的多糖[45]。F.johnsoniae正是借助SprB和RemA等蛋白來推動細胞的自我滑動，而這些黏附蛋白如何錨定在細胞外膜上并沿著一定軌跡運動的機制還有待進一步的研究。

F.johnsoniae能夠分泌幾丁質酶ChiA，該蛋白由兩個GH18家族結構域組成，分子質量為168.9 ku。ChiA基因的插入突變導致細胞失去利用幾丁質的能力，表明ChiA是該菌株降解幾丁質的關鍵酶蛋白。與上述大多數(shù)T9SS轉運蛋白不同的是，ChiA是以游離態(tài)被分泌到培養(yǎng)基質中，而不是錨定在細胞表面；同時，序列分析結果顯示，ChiA的CTD與已知的其他CTD序列相似性很低，可能是一種新型的CTD[46]。因此，CTD或許是決定T9SS轉運蛋白細胞定位的關鍵影響因素。此外，GldK、GldL、GldM、GldN、SprA、SprE或SprT等編碼滑動蛋白相關基因的缺失則會導致分泌的ChiA被錨定在細胞外膜上，說明F.johnsoniae的很多滑動蛋白本身也是T9SS的組成成分，它們除了賦予細胞運動能力，同時也直接參與酶蛋白的胞外轉運過程。

5 總結與展望

與其他已知蛋白分泌系統(tǒng)相比，T9SS的功能與運送機制相對較為獨特，主要體現(xiàn)在兩個方面：一是其組成構造較為復雜，由分布在細胞內膜、周質空間和細胞外膜上的多個組分相互連接構成，所轉運的蛋白底物首先跨細胞內膜被運送至周質空間，經(jīng)過一定加工后再進一步穿過細胞外膜被運送到胞外；二是被運送到胞外的蛋白質，大多數(shù)不能夠游離分泌到培養(yǎng)基質中，而是通過與外膜上的脂多糖A-LPS共價結合而被錨定在細胞表面，并由此形成S層被膜結構(某些微生物中)。因此，以T9SS作為細胞主要蛋白分泌系統(tǒng)的微生物，它們的致病性、運動性、降解生物大分子等生理功能與細胞膜上的錨定蛋白密切相關。

盡管已經(jīng)初步了解了T9SS的組成及蛋白轉運模式，但對其各組分的結構和功能、各組分之間如何相互連接形成復雜的蛋白復合體、蛋白質如何通過外膜上的運送孔道以及蛋白轉運過程的調控機理等具體信息還知之甚少。隨著生物學研究技術的不斷發(fā)展，特別是冷凍電鏡(crys-EM)技術的應用，將有助于更好地了解T9SS這一復雜“細胞機器”的構造，解析蛋白轉運機制。

以C.hutchinsonii和F.johnsoniae為代表的微生物能夠吸附在不溶性多糖底物表面并進行滑動，它們降解多糖的過程依賴于細胞與底物的緊密吸附。錨定在細胞外膜上的多糖降解酶在底物降解過程起著至關重要的作用，但它們是如何被轉運并錨定在細胞表面、CTD是否影響酶蛋白的空間結構及活性、纖維寡糖又是如何被轉運至周質空間等問題目前尚未得到解析。對T9SS結構和功能的深入解析將有助于更清晰地了解微生物的多糖降解機制，或許也有助于發(fā)現(xiàn)新型的多糖降解酶類，從而為工業(yè)酶制劑的研發(fā)提供新的思路。