李淼 李桂祥 劉偉 高曉蘭 王孝友 張安寧

摘要：本研究利用生物信息學(xué)方法從桃全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出7個(gè)NHX反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，并對(duì)其序列特征、基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、亞細(xì)胞定位、組織表達(dá)譜和鹽脅迫響應(yīng)性進(jìn)行綜合分析。結(jié)果表明，7個(gè)桃NHX具有清晰的親緣遠(yuǎn)近關(guān)系;5個(gè)桃NHX（NHX1，NHX4～NHX7）基因在結(jié)構(gòu)等方面具有相似性，親緣關(guān)系較近，而與NHX2和NHX3親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。7個(gè)桃NHX蛋白在N端具有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域。順式元件分析表明，桃NHX基因家族上游啟動(dòng)子區(qū)域包含與光信號(hào)、激素、逆境脅迫及分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用元件。qRTPCR分析結(jié)果顯示，大多數(shù)桃NHX家族成員在莖中表達(dá)較多;所有桃NHX成員對(duì)外源鹽處理具有響應(yīng)性。

關(guān)鍵詞：桃;NHX基因家族;全基因組;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S662.1：Q781文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2021）12-0008-09

Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（Na+/H+ transporters，NHX）在植物耐鹽性方面發(fā)揮著重要作用[1]。NHX能將Na+（K+）區(qū)域化或排出細(xì)胞外以保持植物細(xì)胞內(nèi)較低水平的Na+（K+）濃度，避免細(xì)胞受到傷害，維持其正常生理功能。NHX具有調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓、維持細(xì)胞Na+（K+）濃度、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH 值的功能，是植物耐鹽途徑的重要因子[2-5]。

擬南芥基因SOS1和NHX1是植物中最早被克隆的NHX類基因，這兩個(gè)基因分別定位于細(xì)胞的質(zhì)膜和液泡膜上，分別在細(xì)胞質(zhì)中Na+（K+）向胞外運(yùn)輸和Na+（K+）向液泡的區(qū)域化運(yùn)輸發(fā)揮著重要作用[6，7]。經(jīng)研究，在多種植物中如水稻（OryzasativaLinanaeus）[8]、棉花（Gossypiumherbaceum Linanaeus）[9]、堿蓬（Suaeda glaucaBunge）[10]、柑桔（CitrusreticulataBlanco）[11]等均克隆到相應(yīng)的同源基因。目前，數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的植物NHX類蛋白60多個(gè)。擬南芥中NHX基因家族成員共8個(gè)（AtNHX1～AtNHX8），均參與擬南芥耐鹽代謝途徑。在鹽脅迫條件下，AtNHX1～AtNHX4定位于液泡膜上，能將Na+區(qū)隔化至液泡中[12-15];AtNHX5與AtNHX6定位在內(nèi)膜體上，在調(diào)控細(xì)胞Na+（K+）、pH平衡和鉀營(yíng)養(yǎng)等方面起重要作用[5，16，17];AtNHX7和AtNHX8定位于細(xì)胞膜上，參與細(xì)胞質(zhì)Na+的外排代謝，是植物抵抗鹽離子毒害的首個(gè)屏障[18，19]。綜上，研究NHX基因家族的亞細(xì)胞定位情況是分析NHX基因功能的重要環(huán)節(jié)。

我國(guó)鹽堿化土地主要分布于北方及沿海地區(qū)，占全國(guó)可利用土地面積的4.88%[20]。日益嚴(yán)重的土壤鹽堿化問(wèn)題嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境，如何充分利用鹽堿地資源成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展亟需解決的問(wèn)題。桃樹(shù)抗逆性強(qiáng)，干旱、輕度鹽堿條件下均可正常生長(zhǎng)，解析桃樹(shù)的耐鹽分子機(jī)理和代謝途徑、培育耐鹽新品種可為桃樹(shù)在鹽堿地種植提供一條新途徑。

本研究基于桃（Amygdalusdavidiana）全基因組測(cè)序結(jié)果，對(duì)桃與耐鹽相關(guān)的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體NHX基因家族進(jìn)行鑒定，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行分類及功能預(yù)測(cè)，并測(cè)定這些基因在植物組織的表達(dá)及受到鹽脅迫轉(zhuǎn)錄水平的變化情況，為深入揭示NHX基因家族的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

供試材料為山東省果樹(shù)研究所金牛山試驗(yàn)基地5年生山桃（Amygdalusdavidiana）的各組織（根、莖、葉、花和果實(shí)）。根、莖、葉和花采樣時(shí)間是2020年3月30日，果實(shí)采樣時(shí)間是2020年7月28日。樣品于液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

鹽處理試驗(yàn)離體枝條采自5年生山桃，采樣時(shí)間是2020年7月28日。取長(zhǎng)勢(shì)一致、健康一年生枝條分為兩組：一組放入300mmol/L的NaCl鹽溶液;另一組放入清水（對(duì)照）。置于人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)定溫度25℃，相對(duì)濕度60%左右，光照強(qiáng)度40μmol/（m2·s）。處理0、0.5、1.0、1.5h后取樣，每次每組隨機(jī)選取3根枝條，每根枝條取成熟葉3片立即放入液氮中冷凍，-80℃保存，用于提取RNA進(jìn)行基因表達(dá)分析。

1.2 桃NHX轉(zhuǎn)錄因子的鑒定與表達(dá)分析

1.2.1 桃NHX基因家族成員的檢索 已報(bào)道文獻(xiàn)顯示擬南芥（ArabidopsisthalialaHeynh.）有8個(gè)AtNHXs基因成員、水稻有5個(gè)OsNHXs基因成員、胡楊（PopuluseuphraticaOliver）有6個(gè)PeNHXs基因成員。利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）搜索上述基因的蛋白序列，利用桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)GDR（https：//www.rosaceae.org/）中BLASTP選項(xiàng)搜索比對(duì)。下載比對(duì)出的蛋白序列和對(duì)應(yīng)的基因序列。將候選基因提交至InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，最終確定桃基因組NHX家族成員共7個(gè)。依據(jù)家族成員在染色體上的位置依次命名為PpNHX1～PpNHX7。

利用網(wǎng)站ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)家族成員對(duì)應(yīng)的等電點(diǎn)（pI）、不穩(wěn)定指數(shù)以及親水指數(shù);使用在線網(wǎng)站TMHMMServer（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和軟件IBS（http：//ibs.biocuckoo.org/）預(yù)測(cè)并繪制PpNHXs蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)模型;使用在線網(wǎng)站Softberry（http：//www.softberry.com）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析和基因結(jié)構(gòu)分析 使用MEGA5軟件（https：//www.megasoftware.net）將擬南芥、水稻、胡楊和桃NHX家族全部成員蛋白序列采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）在默認(rèn)參數(shù)下構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

利用桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)GDR獲取家族成員的基因序列和對(duì)應(yīng)編碼區(qū)（CDS）序列，運(yùn)用在線軟件GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行PpNHXs家族成員外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)分析。

1.2.3 桃NHX家族成員啟動(dòng)子順式作用元件分析 在桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)GDR下載各成員基因翻譯起始位點(diǎn)ATG上游2000bp的序列，使用在線網(wǎng)站Plantcare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行作用元件預(yù)測(cè)分析。

1.2.4 桃NHX基因家族的組織表達(dá)分析 對(duì)桃7個(gè)NHX家族成員進(jìn)行組織（根、莖、葉、花和果實(shí)）表達(dá)譜分析，并對(duì)NaCl處理下離體枝條上葉片的表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。用植物總RNA提取試劑盒HiPureHPPlantRNAMiniKit（MagenR4165-02）提取總RNA。以總RNA為模板，采用試劑盒SUM OnetubeRTMixtureⅢ（gDNAremovel）（SUMMERSUM7806a）合成cDNA。采用熒光定量試劑盒qPCRmastermixSybrGreen100Reaction（DBI-2043）配制qRT-PCR體系，以稀釋10倍的cDNA為模板，具體反應(yīng)體系為（20μL）：2×SYBRqPCRMix10μL，正反向引物（10μmol/L）各0.4μL（表1），DNA模板1μL、ddH2O8.2μL;熒光定量PCR儀器為美國(guó)DBI7500fast熒光定量系統(tǒng)。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 10min;94℃ 15s，50℃ 30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán);95℃ 1min，55℃ 30s，95℃ 30s。內(nèi)參基因?yàn)樘一騎ranslationelongationfactor2（TEF2），每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃PpNHXs基因的鑒定和理化性質(zhì)分析

利用桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)共鑒定出7個(gè)PpNHXs基因，根據(jù)其在染色體上的定位依次命名為PpNHX1～PpNHX7（表2）。PpNHXs家族7個(gè)成員CDS長(zhǎng)度在1590～3507bp之間，其中PpNHX4最短，PpNHX2最長(zhǎng)。PpNHXs蛋白氨基酸長(zhǎng)度在529～1168之間，相對(duì)分子質(zhì)量介于58.6～130.2kD。PpNHXs蛋白等電點(diǎn)介于5.53～8.83，其中蛋白PpNHX2～PpNHX5呈酸性，其他呈堿性。PpNHXs蛋白不穩(wěn)定指數(shù)介于34.62～45.61，僅有PpNHX1和PpNHX3的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，說(shuō)明桃PpNHXs蛋白家族中不穩(wěn)定蛋白居多。PpNHXs蛋白的親水指數(shù)在0.058～0.593之間，說(shuō)明桃PpNHXs家族的蛋白均為疏水蛋白。

2.2 桃PpNHXs基因結(jié)構(gòu)分析

利用桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)GDR提供的PpNHXs蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1），結(jié)果顯示，PpNHXs具有清晰的親緣遠(yuǎn)近關(guān)系，PpNHX1、PpNHX4～PpNHX7親緣關(guān)系較近，其與PpNHX2和PpNHX3親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)提供的PpNHXs家族gDNA和cDNA序列繪制每個(gè)成員的基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖2）顯示，7個(gè)PpNHXs基因的外顯子數(shù)在13～23之間不等，外顯子數(shù)目較多。其中，PpNHX1、PpNHX4～PpNHX7外顯子數(shù)目相近，基因長(zhǎng)度差異較小。

2.3 桃PpNHXs蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

使用在線網(wǎng)站TMHMM Server分析桃PpNHXs蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，并利用軟件IBS繪制PpNHXs蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)模型（圖3）。結(jié)果顯示，PpNHX1～PpNHX7均具有跨膜結(jié)構(gòu)域，符合NHX家族跨膜蛋白的特征。PpNHX1、PpNHX4和PpNHX7具有11個(gè)跨膜區(qū)域;PpNHX3、PpNHX5和PpNHX6具有10個(gè)跨膜區(qū)域;PpNHX2具有12個(gè)跨膜區(qū)域，為跨膜區(qū)域個(gè)數(shù)最多的成員。

PpNHXs家族成員的N端、C端在膜兩端的分布存在差異，PpNHX1、PpNHX4和PpNHX7的N端和C端分布于跨膜兩側(cè);PpNHX2、PpNHX3、PpNHX5和PpNHX6的N端和C端分布于跨膜同側(cè)。根據(jù)20種氨基酸的疏水性和親水性，對(duì)7個(gè)桃PpNHXs氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)7個(gè)桃PpNHXs跨膜結(jié)構(gòu)域（N端）均有較大比例的疏水氨基酸異亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、苯丙氨酸（F）、纈氨酸（V）和丙氨酸（A）（表3）。

2.4 桃PpNHXs基因家族成員啟動(dòng)子分析

利用Plantcare軟件對(duì)桃PpNHXs基因家族上游啟動(dòng)子元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析統(tǒng)計(jì)與光信號(hào)、激素、逆境脅迫及分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用元件（圖4）。在7個(gè)桃PpNHXs基因家族的啟動(dòng)子區(qū)域，均具有與光信號(hào)相關(guān)的元件;其中，PpNHX2的光信號(hào)元件最少，為4個(gè);PpNHX5具有的光信號(hào)元件最多，為21個(gè)。與激素相關(guān)的作用元件有生長(zhǎng)素、脫落酸、赤霉素、水楊酸、茉莉酸甲酯;PpNHX2具有5種與激素相關(guān)的作用元件，PpNHX4具有與赤霉素和生長(zhǎng)素相關(guān)的作用元件，PpNHX5具有與脫落酸和水楊酸相關(guān)的作用元件，PpNHX4和PpNHX5為家族中具有激素元件最少的成員。與逆境相關(guān)的作用元件有厭氧誘導(dǎo)、干旱誘導(dǎo)、低溫、防御和應(yīng)激反應(yīng);PpNHX3和PpNHX5均具有4種逆境相關(guān)元件;PpNHX6只具有厭氧誘導(dǎo)相關(guān)元件，為家族中具有逆境相關(guān)元件最少的成員。PpNHX4、PpNHX5和PpNHX7基因的啟動(dòng)子上含有與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用元件;PpNHX6和PpNHX7的啟動(dòng)子上含有與胚乳表達(dá)相關(guān)的順式作用元件。

通過(guò)分析桃PpNHXs基因家族上游啟動(dòng)子元件，發(fā)現(xiàn)PpNHXs家族與光信號(hào)、激素、逆境脅迫及分生組織表達(dá)有密切關(guān)系，說(shuō)明PpNHXs基因家族在生長(zhǎng)發(fā)育、激素調(diào)控、抵抗逆境脅迫方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。

2.5 桃PpNHXs基因家族成員的表達(dá)分析

2.5.1 組織特異性 對(duì)7個(gè)桃PpNHXs基因家族成員進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明（圖5），PpNHX1～PpNHX7在山桃根、莖、葉、花和果實(shí)均有表達(dá);PpNHX1在莖中相對(duì)表達(dá)量較高，PpNHX2在根和莖中相對(duì)表達(dá)量較高，PpNHX3在各組織表達(dá)量相對(duì)均勻;PpNHX4、PpNHX5和PpNHX7主要在莖中表達(dá)，其次在花中;PpNHX6在果實(shí)中相對(duì)表達(dá)量最高。

2.5.2 桃PpNHXs響應(yīng)鹽脅迫的表達(dá)分析 由圖6可知，離體枝條葉片經(jīng)過(guò)NaCl溶液處理后，7個(gè)PpNHXs基因均出現(xiàn)不同變化。鹽處理下的PpNHX1和PpNHX2基因在0～1.5h變化趨勢(shì)是一致的，均為先升高后降低然后趨于平穩(wěn);PpNHX5、PpNHX6和PpNHX7的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比均明顯降低;PpNHX3的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組;PpNHX4的相對(duì)表達(dá)量0～0.5h高于對(duì)照，1h后低于對(duì)照。

3 討論與結(jié)論

本研究共鑒定出7個(gè)PpNHXs基因家族成員，與擬南芥（8個(gè)）、水稻（5個(gè)）和葡萄（8個(gè)）的NHX家族成員數(shù)量相近[21-23]。通過(guò)對(duì)擬南芥、水稻、胡楊和桃基因組NHX家族成員親緣關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)每種植物的NHX家族成員在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中分布均勻，相同植物的NHX基因家族成員聚在同一個(gè)分支的現(xiàn)象較少，說(shuō)明不同植物間NHX家族成員多為直系同源基因，如PpNHX1和PeNHX4、PpNHX4和AtNHX3;相比于其他基因家族如MYB、SAUR、NAC等擁有50～100個(gè)家族成員，不同植物基因組NHX家族成員個(gè)數(shù)較少，主要是NHX家族發(fā)生復(fù)制事件較少，即旁系同源基因（如AtNHX7和AtNHX8）對(duì)數(shù)較少。

通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，PpNHX2、PpNHX3與其他5個(gè)PpNHXs成員親緣關(guān)系較遠(yuǎn);通過(guò)分析基因外顯子數(shù)目、基因長(zhǎng)度，發(fā)現(xiàn)PpNHX2、PpNHX3與其他5個(gè)PpNHXs成員在基因結(jié)構(gòu)上差異較大。PpNHX2、PpNHX3在桃基因組上具有結(jié)構(gòu)和序列特異性，這種特異性預(yù)示著基因功能的特異性，為后續(xù)的基因功能分析奠定了基礎(chǔ)。

NHX基因家族最明顯的結(jié)構(gòu)特征為跨膜結(jié)構(gòu)域[18]。NHX跨膜結(jié)構(gòu)集中分布在疏水性較強(qiáng)的N端，而親水性較強(qiáng)的長(zhǎng)序列C端分布在不同細(xì)胞器中，具有感知信號(hào)、調(diào)控蛋白等功能[24]。在擬南芥AtNHXs基因家族中共鑒定出8個(gè)AtNHXs成員;根據(jù)在亞細(xì)胞器的定位可以分為3類，液泡膜NHX（AtNHX1～AtNHX4）、內(nèi)膜NHX（AtNHX5和AtNHX6）和質(zhì)膜NHX（AtNHX7和AtNHX8）[25]。PpNHX2定位在質(zhì)膜上，這與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中親緣關(guān)系較近的AtNHX7、AtNHX8蛋白定位一致;系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中唯一與AtNHX5、AtNHX6親緣關(guān)系近的PpNHX3定位在高爾基體上，這與AtNHX5、AtNHX6蛋白定位一致;PpNHX1、PpNHX4～PpNHX7與AtNHX1～AtNHX4具有較近的親緣關(guān)系，但PpNHX1、PpNHX4～PpNHX7蛋白定位均未在液泡膜上，與AtNHX1～AtNHX4的蛋白定位不一致。本研究認(rèn)為至少存在1～2個(gè)PpNHX在液泡膜上，調(diào)節(jié)細(xì)胞液泡Na+的平衡和滲透壓，但該結(jié)論需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

在桃PpNHXs組織表達(dá)分析中，7個(gè)PpNHXs表達(dá)具有特異性，表明7個(gè)PpNHXs在不同組織具有各自功能特點(diǎn);但PpNHXs普遍在根和莖組織表達(dá)較高，因根和莖是植物抵御外界有害物質(zhì)進(jìn)入和運(yùn)輸至體內(nèi)各部的重要關(guān)口，較多的PpNHXs分布在根和莖組織內(nèi)對(duì)提高桃抗逆性具有重要作用。通過(guò)分析桃PpNHXs啟動(dòng)子順式作用元件，發(fā)現(xiàn)大量與激素、抵抗逆境相關(guān)的元件。通過(guò)鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)每個(gè)PpNHX的表達(dá)出現(xiàn)明顯變化，說(shuō)明7個(gè)PpNHXs均參與體內(nèi)耐鹽代謝;PpNHX1～PpNHX3的表達(dá)量高于對(duì)照，說(shuō)明其可能正向調(diào)控耐鹽代謝途徑;PpNHX4的表達(dá)量先高于對(duì)照，1h后低于對(duì)照，說(shuō)明其可能正向參與體內(nèi)耐鹽代謝，只是基因表達(dá)的持續(xù)性不如基因PpNHX1～PpNHX3。PpNHX5～PpNHX7表達(dá)出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，說(shuō)明其可能負(fù)向調(diào)控體內(nèi)耐鹽代謝。

綜上，本研究對(duì)桃PpNHXs基因家族進(jìn)行全基因鑒定、生物信息分析、跨膜結(jié)構(gòu)分析和表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)該基因家族結(jié)構(gòu)特點(diǎn)明顯、功能多樣，尤其與抵抗逆境聯(lián)系密切。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究和利用桃PpNHXs基因家族奠定基礎(chǔ)。