宋延靜 馬蘭 李俊林 單燕 王潔 趙玲玲 王向譽

摘要：蘆葦是山東省鹽漬化地區(qū)常見的濕地鹽生植物，對氮素轉化以及氮去除有重要作用，其中微生物介導的反硝化過程被認為是主要的除氮機理。本研究以山東省不同鹽漬化地區(qū)的蘆葦根際土為材料，采用熒光定量PCR技術及高通量測序技術，對nirS、nirK及nosZ3種基因型反硝化細菌的豐度以及nosZ基因型反硝化細菌的多樣性、群落分布進行比較分析。結果表明，山東省鹽漬化地區(qū)的蘆葦根際中nosZ基因的拷貝數最高，昌邑和壽光地區(qū)的蘆葦根際nirK基因拷貝數高于nirS，東營和濱州的蘆葦根際nirS基因拷貝數高于nirK。固氮螺菌屬（Azospirillum）是山東省鹽漬化地區(qū)蘆葦根際的優(yōu)勢反硝化細菌，尤其在昌邑（39.1%）和濱州地區(qū)（35.1%），Oligotropha是壽光蘆葦根際豐度最高的反硝化菌（27.3%），假單胞菌屬（Pseudomonas）是東營地區(qū)蘆葦根際豐度最高的反硝化細菌（34.4%）。濱州地區(qū)的蘆葦根際反硝化細菌多樣性最高。昌邑和壽光兩地的蘆葦根際nosZ反硝化細菌群落結構相似，東營和濱州兩地nosZ反硝化細菌群落組成差異較小。土壤的含鹽量、Na+含量、含水量、總碳含量、銨鹽以及pH值等環(huán)境因子均可影響蘆葦根際nosZ基因型反硝化細菌的群落結構。

關鍵詞：蘆葦;反硝化細菌;nirS、nirK、nosZ基因;熒光定量PCR;高通量測序

中圖分類號：S564+.2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2021）12-0137-06

反硝化作用被認為是最主要且有效的氮素削減途徑，其氣體產物N2O是三大溫室氣體之一[1]。大量研究表明反硝化過程所需的酶類并不能夠由某一類微生物單獨產生，而是需要通過多種微生物共同作用[2]。隨著微生物分子生態(tài)技術的發(fā)展，可以利用功能基因對環(huán)境中反硝化功能微生物的群落結構進行研究。編碼亞硝酸還原酶的基因nirS與nirK是反硝化微生物種群研究中普遍使用的分子標記物，其參與的亞硝酸鹽還原反應是一氧化氮產生的步驟[3];另外一個在反硝化微生物種群研究中應用相當廣泛的基因是編碼N2O還原酶（Nos）的nosZ基因[4]，該酶在N2O和N2的產生過程中起重要作用。nirS、nirK與nosZ之間的平衡關系可以作為土壤N2O排放能力的一個參考指標[5]。

山東省的鹽漬化地區(qū)多為濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)，蘆葦根系發(fā)達，抗逆性強，是該地區(qū)常見的濕地鹽生植物，在氮素轉化和去除過程中起重要作用，因此蘆葦的種植有利于提高濕地脫氮能力。植物根際作為一個特殊的微生物生態(tài)環(huán)境，對微生物的生長有重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)黃河三角洲地區(qū)蘆葦根際氨氧化微生物的組成和分布存在差異[6]，本研究基于nirS、nirK、nosZ功能基因，結合熒光定量PCR技術與高通量測序技術對山東省不同鹽漬化地區(qū)（濱州、東營、昌邑、壽光）蘆葦根際反硝化微生物的豐度、多樣性和群落結構進行比較，同時研究其與環(huán)境因子的相關性，以期為山東省鹽漬化土壤生態(tài)環(huán)境的合理開發(fā)利用及保護提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2017年11月沿山東省海岸線進行鹽漬化土壤背景下的蘆葦資源調查及其根際土的收集，采樣點位圖見參考文獻[7]的圖1。土壤具體理化性質見參考文獻[6]。

1.2 土壤DNA的提取和高通量測序

按照FastDNA SPINKitforSoil試劑盒說明書步驟提取DNA，用分光光度計（NanoDrop2000c）測定DNA的濃度及純度。利用nosZ基因特異性引物進行PCR擴增（表1），然后利用IlluminaPE250測序平臺進行測序（上海凌恩生物科技有限公司）。

1.3 熒光定量PCR

nirS、nirK、nosZ三個基因的拷貝數采用TBGreen熒光定量PCR法獲得，具體引物信息見表1，反應在BioRadCFX96平臺上進行。稀釋相應的質粒至10-1～10-8，并繪制標準曲線。每個樣品3次重復，設不加模板的反應管為陰性對照。

1.4 高通量數據分析

反硝化微生物的多樣性分析基于nosZ基因進行，高通量數據分析基于Linux平臺的QIIME1.9.0流程，參考數據庫為FGR（version7.3）。具體流程如下：過濾read尾部質量值20以下的堿基和質控后50bp以下的read;篩除錯配比率大于0.2的拼接序列;用Usearch軟件和gold數據庫，采用denovo和reference結合的方式去除嵌合體，并選取97%的序列相似度作為閾值（cutoff）劃分OTU;采用RDPclassifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析。

1.5 數據處理

利用SPSS20統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析（ANOVA）檢驗不同采樣點蘆葦根際土中nirS、nirK、nosZ基因拷貝數的差異顯著性;利用mothur計算不同地域蘆葦根際反硝化微生物類群的α多樣性指數;利用Primer軟件進行聚類樹分析;應用CANOCO軟件中的典范對應分析（CCA）探索微生物群落結構與環(huán)境變量之間的關系[12]。

2 結果與分析

2.1 蘆葦根際nirS、nirK、nosZ基因拷貝數的比較

熒光定量PCR結果（圖1）顯示，4個采樣點的蘆葦根際反硝化功能基因的拷貝數表現(xiàn)為nosZ基因拷貝數最高，其次是nirK和nirS基因。昌邑和壽光地區(qū)的蘆葦根際nirK拷貝數高于nirS拷貝數，東營和濱州地區(qū)的蘆葦根際nirS拷貝數高于nirK拷貝數。

對于nosZ基因，東營地區(qū)拷貝數最高，平均值為4.88×109 copies/g;其次是濱州地區(qū)（4.49×109copies/g）;壽光和昌邑的nosZ拷貝數相對較低，分別為8.37×108copies/g和2.91×108copies/g。對于nirS基因，東營地區(qū)的蘆葦根際拷貝數最高，為7.17×108copies/g;其次是濱州地區(qū)，平均值為1.85×108copies/g;昌邑地區(qū)的蘆葦根際nirS拷貝數最低，為6.94×106copies/g。對于nirK基因，濱州地區(qū)蘆葦根際拷貝數最高，為1.36×108copies/g;其次依次為昌邑、東營和壽光，平均值分別為8.22×107、6.95×107、2.83×107copies/g。

2.2 蘆葦根際nosZ基因型反硝化細菌的α多樣性

對nosZ基因進行高通量測序，結果（表2）表明，采樣點蘆葦根際nosZ基因型反硝化細菌的OTU數量平均在999～1755之間。由Chao1指數可知，各采樣點的蘆葦根際反硝化微生物豐富度排序為昌邑>濱州>壽光>東營;由Shannon指數可知，各采樣點的蘆葦根際反硝化細菌多樣性濱州>昌邑>壽光>東營;由Simpson指數可知，各采樣點的蘆葦根際反硝化細菌多樣性濱州>東營>昌邑>壽光。

2.3 蘆葦根際nosZ基因型反硝化細菌群落組成分析

山東省鹽漬化地區(qū)蘆葦根際反硝化細菌主要為變形菌門（Proteobacteria）。從圖2可以看出，從屬水平來看，固氮螺菌屬（Azospirillum）是蘆葦根際優(yōu)勢反硝化菌屬，尤其是昌邑（39.1%）和濱州地區(qū)（35.1%）;鹽單胞菌屬（Halomonas）是濱州蘆葦根際除固氮螺菌屬以外豐度最高的優(yōu)勢菌（22.2%），該菌在其它三地蘆葦根際含量較低，豐度均不到1%;Oligotropha是壽光蘆葦根際豐度最高的反硝化細菌（27.3%），中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）是昌邑地區(qū)除固氮螺菌屬以外豐度最高的反硝化細菌（28.5%），假單胞菌屬（Pseudomonas）是東營地區(qū)蘆葦根際豐度最高的反硝化細菌（34.4%）。在4個不同采樣點的蘆葦根際還發(fā)現(xiàn)很大比例的未知微生物，尤其是東營和壽光地區(qū)。其他相對豐度較高的蘆葦根際優(yōu)勢反硝化菌屬還包括紅細菌屬（Rhodobacter）、紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）、魯杰氏菌屬（Ruegeria）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）等。

2.4 蘆葦根際nosZ基因型反硝化細菌在山東省不同鹽漬化地區(qū)的空間分布差異及環(huán)境影響因子

聚類樹分析結果（圖3）表明，蘆葦根際nosZ基因型反硝化細菌被分為兩大分支，第一大分支包含壽光（SG）和昌邑（CY），第二大分支包含東營（DY）和濱州（BZ）。結合樣本在樹狀圖中的位置以及樹狀圖中樹枝長度可知，東營和濱州地區(qū)的蘆葦根際nosZ基因型反硝化細菌群落組成相似度較高，壽光和昌邑地區(qū)的蘆葦根際nosZ基因型反硝化細菌群落組成差異較小。

典范對應分析（圖4）發(fā)現(xiàn)山東鹽漬化地區(qū)蘆葦根際反硝化細菌的群落結構受含鹽量、Na+含量、含水量、總碳含量、銨鹽、pH值的影響較大。第一軸解釋率為43.9%，第二軸解釋率為28.7%。

3 討論與結論

蘆葦根系發(fā)達，繁殖速度快，是山東濱海鹽漬化地區(qū)常見的鹽生濕地植物。蘆葦發(fā)達的根系為微生物的生長提供了依附介質和環(huán)境，植物根系的分泌物和脫落物是微生物生長的重要營養(yǎng)來源。蘆葦-微生物系統(tǒng)對該地區(qū)的氮素循環(huán)尤其是反硝化過程有巨大影響。

3.1 山東省鹽漬化地區(qū)蘆葦根際不同基因型反硝化細菌的豐度特征

本研究發(fā)現(xiàn)山東濱海鹽漬化地區(qū)的蘆葦根際反硝化細菌中nosZ基因型占主導。

有研究表明，nirS型與nirK型反硝化細菌在不同的環(huán)境中均可共存，但不同的環(huán)境中nirK與nirS的豐度不同，通常認為nirS型反硝化細菌具有更高的基因豐度，在環(huán)境中占據主導地位，而nirK型反硝化細菌存在于更為廣泛的微生物種群中[2，13];也有研究表明土壤樣品中nirK基因的拷貝數高于nirS[14]。本試驗結果表明，對于昌邑和壽光地區(qū)，蘆葦根際nirK拷貝數高于nirS拷貝數，對于東營和濱州地區(qū)，nirS拷貝數高于nirK拷貝數。前人研究表明環(huán)境中nirS與nirK的豐度差異取決于樣帶及養(yǎng)分含量[15]，nirS型反硝化細菌更適于有機碳、NO-3 -N含量高的環(huán)境[16，17]，nirK型反硝化細菌在對不同環(huán)境梯度的響應中表現(xiàn)出了更為強大的生境選擇。本研究結果顯示東營和濱州地區(qū)土壤中的有機碳含量等顯著高于昌邑和壽光地區(qū)，因此更適宜于nirS基因型反硝化細菌的生長。

3.2 山東省鹽漬化地區(qū)蘆葦根際nosZ基因型反硝化細菌的分布特征

在門水平上，山東省不同鹽漬化地區(qū)蘆葦根際反硝化細菌表現(xiàn)一致，主要為變形菌門，與大多數研究結果一致[18，19]。在屬水平上，4個地區(qū)蘆葦根際反硝化細菌具有差異，變形菌門γ綱的固氮螺菌屬（Azospirillum）是4個地區(qū)中蘆葦根際的優(yōu)勢反硝化菌屬。固氮螺菌是一種主要的固氮細菌，與禾本科作物起到聯(lián)合固氮的作用。鹽單胞菌屬（Halomonas）是濱州蘆葦根際豐度較高的反硝化菌屬（22.2%），但鹽單胞菌屬在其它3地的蘆葦根際豐度較低，均不到1%。鹽單胞菌是可培養(yǎng)的優(yōu)勢好氧反硝化菌，且嗜鹽，適宜堿性土壤，鹽單胞菌屬在濱州地區(qū)的高豐度可能與該地區(qū)土壤鹽分、pH 值較高有關。假單胞菌屬（Pseudomonas）是東營地區(qū)蘆葦根際的優(yōu)勢反硝化細菌（34.4%），假單胞菌屬是目前已知的反硝化細菌中最大的類群之一，可以去除較高的硝酸鹽氮[20]。此外，各地區(qū)蘆葦根際相對豐度較高的還有未分類的變形桿菌（unclassifiedProteobacteria），這表明主導蘆葦根際反硝化作用的可能還有一些獨特的未被鑒定的反硝化菌屬。

聚類分析顯示地理位置相近的昌邑和壽光地區(qū)蘆葦根際nosZ型反硝化細菌的群落組成相似，濱州和東營兩地區(qū)的蘆葦根際nosZ型反硝化細菌的群落組成相似，結合環(huán)境因子分析發(fā)現(xiàn)在山東省鹽漬化地區(qū)，土壤的含鹽量、Na+含量、含水量、總碳含量、銨鹽以及pH值等環(huán)境因子均可影響反硝化微生物的群落結構，與之前的研究結果相一致[21-23]。