劉道華，汪天平

安徽省寄生蟲病防治研究所，安徽 合肥 230601

弓形蟲病(toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲寄生人體導致的人獸共患機會性寄生蟲病，呈世界性分布。免疫機能正常者感染弓形蟲常呈自限性，無明顯臨床表現(xiàn)，多呈隱性感染狀態(tài)。AIDS患者和腫瘤患者等免疫功能低下者感染弓形蟲常導致嚴重后果，主要表現(xiàn)為腦炎、視網(wǎng)膜脈絡膜炎或精神異常等，嚴重者可引起死亡[1-2]。孕婦感染弓形蟲可通過胎盤垂直傳播，引起不良妊娠結局，或引起嬰兒先天性弓形蟲病[3-5]。

目前，弓形蟲病的診斷方法主要分為病原學方法、免疫學方法及分子生物學方法。病原學檢測包括直接鏡檢、滋養(yǎng)體檢查及動物組織內(nèi)包囊的檢查等。但病原學檢測所需時間較長，且敏感性和特異性較差。免疫學方法主要檢測血清或組織液等標本中的弓形蟲抗體，適用于流行病學調(diào)查，但易出現(xiàn)假陽性，只能作為弓形蟲病的輔助診斷。分子生物學技術的許多新方法也逐漸應用于弓形蟲病的診斷，為弓形蟲病的診斷提供了強有力的技術支撐。本文旨在對分子生物學的新技術和新方法在弓形蟲病診斷中的應用及發(fā)展前景等進行綜述。

1 核酸分子雜交

核酸分子雜交技術是依據(jù)核酸分子的變性、復性，使來源不同的DNA(或RNA)片段，按照堿基互補配對的原則形成雜交雙鏈分子。核酸分子雜交具有特異性高、靈敏性強等優(yōu)點，國內(nèi)外學者陸續(xù)將其應用于弓形蟲病的診斷。

夏愛娣等[6]采用32P標記的弓形蟲DNA探針與無腦兒、腦積水及死胎標本的DNA進行核酸分子雜交，成功檢測出弓形蟲陽性標本。陳海峰等[7]用RH株弓形蟲抗原SAG1基因編碼序列，構建pcDNA3-SAG1重組表達質(zhì)粒，運用核酸分子雜交方法可以檢測弓形蟲SAG1的存在。張洪花等[8]應用生物素標記的核酸探針檢測腦囊蟲病人、癲癇患者及健康人群的弓形蟲感染狀況，發(fā)現(xiàn)核酸分子雜交技術可應用于弓形蟲病的現(xiàn)場調(diào)查。此外，研究者通過PCR擴增弓形蟲TGR4核酸片段，用地高辛標記探針和待測樣本進行核酸雜交，結果顯示，此探針不僅特異性較好，且具有較好的敏感性[9]。國外相關研究者采用同位素標記探針的酶聯(lián)免疫滲濾試驗檢測弓形蟲的DNA，結果發(fā)現(xiàn)核酸分子雜交技術具有較好的敏感性、特異性，還可節(jié)約時間，實現(xiàn)操作的自動化[10]。

2 聚合酶鏈式反應(PCR)

20世紀80年代，美國PE公司成功推出了一套快速DNA擴增系統(tǒng)，使目的DNA片段的拷貝數(shù)擴增至百萬倍以上，具有特異、敏感和操作簡便等優(yōu)點[11]。隨著PCR技術的深入研究和快速發(fā)展，衍生出了巢氏PCR、熒光定量PCR、原位PCR、多重PCR等相關技術，這些方法均逐漸應用于弓形蟲病的診斷。

2.1常規(guī)PCR PCR利用堿基互補配對的原則，經(jīng)高溫變性、低溫復性、子鏈延伸的不斷循環(huán)，在體外快速、選擇性地擴增目的基因。 謝德華等[12]以弓形蟲核糖體DNA第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1)序列作為遺傳標記，利用上游引物：5'-GATTTGCATTCAAGAAGCGTGATAGTAT-3'，下游引物：5'-AGTTTAGGAAGCAATCTGAAAGCACATC-3'，構建了PCR診斷方法。該方法可檢測出10個弓形蟲速殖子DNA，且與其他8種原蟲和線蟲均無交叉反應，證實該方法具有較高的靈敏性和特異性。此外，有關學者以弓形蟲高度重復基因序列 529 bp建立了PCR診斷方法，最低可檢測出10個拷貝的弓形蟲DNA片段[13]。

PCR技術建立起來后，迅速應用到臨床試驗。研究者采用PCR技術對生殖道、分泌物、孕婦和3個月以下嬰兒全血進行弓形蟲感染的檢測，同時采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進行了比較分析，證實了PCR技術檢測弓形蟲感染具有較高的可靠性[14-15]。

2.2巢式PCR 巢式PCR是對常規(guī)PCR技術的完善、改進及發(fā)展，應用兩對引物擴增DNA片段。Fuentes等[16]首次采用根據(jù)弓形蟲B1基因建立了巢氏PCR，所用上游引物：5'-GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3'，下游引物：5'-TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC-3'，并用該方法檢測尿液中弓形蟲DNA，進行嬰兒先天性弓形蟲病的產(chǎn)前診斷。另外，國外有學者根據(jù)弓形蟲B1基因構建了巢式PCR，并證實該方法可確診弓形蟲性視網(wǎng)膜脈絡膜炎[17]。張瑩光等[18]根據(jù)弓形蟲529 bp重復序列設計引物，建立巢式PCR檢測方法，檢測出0.1 pg的弓形蟲DNA，其最低檢測限比常規(guī)PCR提高了100倍，且該方法對蜥蜴利什曼原蟲、隱孢子蟲、細粒棘球絳蟲基因組擴增無條帶，特異性強。程寧等[19]采用巢式PCR對早產(chǎn)兒和正常新生兒進行弓形蟲DNA的篩查，結果發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒弓形蟲感染率較高，提示弓形蟲感染可能是引起早產(chǎn)的危險因素之一。

隨著巢式PCR的發(fā)展，又出現(xiàn)了半巢式PCR技術。半巢式PCR應用3條引物而進行2次PCR擴增，具有操作簡便、特異性強、靈敏性高等優(yōu)點。王素華[20]利用弓形蟲RH株的P30基因設計了3條特異性引物P1、P2及P3，成功構建半巢氏PCR 檢測技術，并證實該方法靈敏性高，可檢測18 fg的弓形蟲DNA。孔得翔等[21]同樣利用弓形蟲的P30基因為作為研究對象，建立了半巢式PCR檢測體系，證實了最低可檢測18 fg的弓形蟲DNA，極大地提高了檢出率，為弓形蟲早期診斷奠定基礎。

2.3熒光定量PCR 熒光定量PCR，又稱為實時定量PCR，將探針技術與PCR技術有機結合，通過測定PCR產(chǎn)物中的DNA含量來定量分析待檢樣本中目的DNA或者mRNA的含量。

近年來，國內(nèi)外學者根據(jù)GenBank中弓形蟲529 bp重復序列、GRA7基因、B1基因及GRA6基因分別設計熒光定量PCR的引物，成功構建了弓形蟲熒光定量PCR檢測方法[22-23]。研究者還利用構建的熒光定量PCR方法，對無償獻血者進行弓形蟲感染的篩查，對病死豬及組織樣品進行弓形蟲感染情況的檢測，并與常規(guī)PCR方法進行比較分析，結果發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR法的檢出率顯著高于常規(guī)PCR法[24]。此外，采用特定熒光定量PCR引物對新孢子蟲、牛巴貝斯蟲等寄生蟲DNA的檢測，結果均為陰性，顯示出較好的特異性[25]。因此，熒光定量PCR比常規(guī)PCR技術更加快捷、敏感、準確，適合臨床實驗室及相關標本弓形蟲感染的檢測。

2.4原位PCR 1990年，Hasse等人將PCR技術和原位雜交技術結合在一起，成功建立了原位多聚酶鏈式反應技術，簡稱原位PCR[26]。原位PCR將原位雜交的定位性與PCR的高度敏感性結合，極大地提高了原位雜交對低復制樣品檢測的敏感性，克服了PCR技術因擴增產(chǎn)物無法在細胞組織中定位而不能與形態(tài)學特征結合的不足。

李爽等[27]以弓形蟲RH株的速殖子感染小鼠，取肝臟制備了石蠟標本及冰凍切片標本，采用直接原位PCR擴增并檢測石蠟標本中的弓形蟲DNA，結果弓形蟲病原體檢出率為100%，顯著優(yōu)于免疫組化法。盧慎[28]應用間接原位PCR技術，檢測3所醫(yī)院共86例病理診斷為慢性非特異性淋巴結炎患者石蠟包埋切片組織中的弓形蟲DNA，結果發(fā)現(xiàn)47例弓形蟲陽性，占54.65%。此外，他還采用免疫組化、原位雜交及間接原位PCR技術三種方法，檢測71例診斷為慢性非特異性淋巴結炎(淋巴結反應性增生)患者組織切片中的弓形蟲，結果發(fā)現(xiàn)，間接原位PCR的檢出率明顯高于免疫組化和原位雜交法[29]。

2.5多重PCR 多重PCR(MPCR)又稱多重引物PCR或復合PCR技術，是1988年Chamberlian等首次提出的[30]。多重PCR的主要優(yōu)勢是在同一個反應體系中加入兩對或兩對以上引物，分別擴增不同的模板，可同時得到不同的目的片段。因此，多重PCR技術不但保留了常規(guī)PCR方法的特異性及敏感性，而且減少了操作步驟和試劑用量，提高了檢測效率，節(jié)約了檢測成本。

趙錦等[31]成功構建了可同時檢測弓形蟲和乙肝DNA的多重PCR，以乙肝病人血液及弓形蟲RH實驗動物腹水為樣本，通過基因片段篩選，進行弓形蟲和乙肝病毒基因片段的擴增，證明該方法能夠有效診斷弓形蟲感染，可用于弓形蟲感染的實驗室篩查。彭武麗等[32]以牛新孢子蟲Nc-5基因和弓形蟲GRA6基因作為目的基因，各設計一對PCR引物，建立了可同時檢測牛新孢子蟲和弓形蟲的雙重PCR方法，并用該方法對臨床樣品進行篩檢，證明此方法具有較好的特異性和重復性。于新友等[33]依據(jù)GenBank中豬弓形蟲和附紅細胞體核苷酸序列，分別設計兩對引物，優(yōu)化雙重PCR反應條件，成功構建了雙重PCR檢測體系，此方法可同時進行這兩種病原的檢測。

3 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)

2000年，日本學者Notomi等人研發(fā)了一種快速、簡單、靈敏、特異且低成本的恒溫核酸擴增技術，即LAMP技術[34]。LAMP技術具有擴增效率高、操作步驟簡單、靈敏性極高、特異度好、結果判定簡便等諸多優(yōu)點。LAMP技術一經(jīng)問世，迅速應用于寄生蟲病領域，并取得良好效果。

近年來，研究者根據(jù)弓形蟲SAG1基因、529 bp高度重復序列，分別設計兩對特異性引物，不斷優(yōu)化反應步驟和實驗條件，成功構建了LAMP法。在建立LAMP技術的基礎上，對人血清和人工接種動物肌肉組織弓形蟲感染情況進行檢測，并與常規(guī)PCR法、ELISA法進行對比分析，結果發(fā)現(xiàn)LAMP法的最低檢測限比傳統(tǒng)PCR提高了100倍，且與其他人體常見寄生蟲及原蟲無任何交叉反應現(xiàn)象，還可彌補ELISA 法僅檢測弓形蟲抗體而無法確診的不足[35-36]。此外，LAMP法也被應用到豬弓形蟲病的診斷。在建立豬弓形蟲病LAMP檢測體系的基礎上，對豬血液樣本進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)LAMP法具有極高的敏感性，且與常見病原體沒有交叉反應，能夠作為判斷家畜是否感染弓形蟲的分子檢測手段[37-38]。

4 基因芯片技術

基因芯片技術又稱DNA芯片技術，是將大量的探針分子固定于支持物后與待檢樣本雜交，依據(jù)檢測探針上的雜交信號而獲取待檢樣本的相關信息?；蛐酒哂懈咄俊⑽⑿突?、多樣化和自動化等諸多優(yōu)勢。近年來，基因芯片技術飛速發(fā)展，并逐漸應用于醫(yī)學研究領域，在疾病的診斷、藥物靶點的篩選和致病基因的測序等方面得到了廣泛應用，發(fā)展前景十分廣闊[39-42]。

易廣才[43]依據(jù)Genbank 中弓形蟲(TOX)、風疹病毒(RV)、巨細胞病毒(HCMV169)、單純皰疹病毒(HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ)基因序列分別設計16只寡核苷酸探針，成功構建基因芯片技術，證明該基因芯片可同時檢測5種致病微生物，并與熒光定量PCR法進行比較，結果基本一致。此外，研究者根據(jù)弓形蟲基因和常見人獸共患病原基因作為目的基因，設計合成特異性引物及適宜探針，成功構建了液相基因芯片檢測方法，并通過實驗證實，該方法檢測弓形蟲感染具有較好的敏感性和特異性[44-45]。

5 基因測序技術

基因測序技術是鑒定目的基因最準確的方法，最早建立的DNA測序方法有兩種，即Sanger雙脫氧末端終止法和化學降解法[46]。人類基因組計劃的實施推動了基因測序技術的發(fā)展，在第一代基因測序技術的基礎上，已經(jīng)發(fā)展到第二代測序技術、第三代單分子測序技術和單細胞測序技術。

郭玲玲等[47]提取弓形蟲RH株速殖子總RNA，根據(jù)棒狀體蛋白18基因(TgROP18)的開放閱讀框設計引物，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增ROP18基因，并對其產(chǎn)物進行測序，經(jīng)生物信息學分析表明，TgROP18蛋白具有良好的免疫原性，為弓形蟲疫苗的研究提供基礎資料。劉楠等[48]提取弓形蟲總RNA，根據(jù)TgROP16基因的開放閱讀框架設計引物，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴增ROP16基因，經(jīng)基因測序及生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，TgROP16蛋白具有良好的抗原性及免疫原性，有望作為弓形蟲疫苗候選分子。章瑩等[49]成功提取了弓形蟲RH株的cDNA和基因組DNA，經(jīng)酶切反應、PCR擴增及基因序列測定，發(fā)現(xiàn)了在原核表達系統(tǒng)中高效表達的重組蛋白，該重組蛋白具有較好的生物學活性，可能成為弓形蟲特異性藥物靶標之一。

6 結 語

綜上所述，核酸分子雜交技術具有特異性強、靈敏度高的優(yōu)點，且可對DNA或RNA進行定性、定量檢測。PCR技術及衍生的諸多新分子生物學技術，不僅提高了弓形蟲病檢測的敏感性和特異性，而且為弓形蟲病的實驗室診斷和流行病學篩查提供了強有力的技術支持。LAMP法在檢測弓形蟲感染方面具有快速簡便、敏感性高、設備要求低等優(yōu)點，應用前景良好?；蛐酒夹g和基因測序技術逐漸應用于弓形蟲病的診斷、藥物靶點的篩選等方面，其發(fā)展前景令人期待。隨著分子生物學檢測技術的飛速發(fā)展和不斷完善，其作為一種可彌補病原學、免疫學檢測不足的新方法，必將給弓形蟲病的診斷提供更強有力的技術支撐。