鄭 興 ，吝思琪 ，楊守國 ，張興志，VASQUEZ Herbert Ely，顧志峰，王愛民

（1.海南大學海洋學院，海南 海口 570228；2.海南大學/南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 ?？?570228；3.海南省海洋與漁業(yè)科學院，海南 ?？?571126；4.廣西水產科學研究院，廣西 南寧 530021）

微藻是地球上最早利用太陽能進行光合作用的生命體之一，是微觀的、低等單細胞水生生物，具有太陽能利用效率高、適應環(huán)境能力強等特點[1]。微藻含蛋白質、氨基酸、多糖、維生素、不飽和脂肪酸和色素等多種高附加值的生物物質[2-3]。其種類繁多，目前已知兩萬多種。人類利用微藻已有幾百年歷史，主要集中在食用、活性物質提取利用、生物能源提取利用、環(huán)境治理等方面[4-7]，微藻在海水養(yǎng)殖中一般用作水產動物的開口餌料。熱帶普通小球藻 (Chlorella vulgaris) 屬于綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、卵囊藻科、小球藻屬，是一類普生性的單細胞綠藻，含有蛋白質、多糖、細胞色素、不飽和脂肪酸和生物生長因子等多種豐富的營養(yǎng)物質，開發(fā)應用前景十分廣闊[8-9]。小球藻在1950 年首次成功被人工培養(yǎng)后，一直是研究者和生產者關注的焦點，其形態(tài)、營養(yǎng)特性、生產培養(yǎng)方式、加工及應用等方面被廣泛研究[10]。

微藻的生長過程可簡單分為接種期、快速生長期 (指數生長期)、穩(wěn)定期和衰亡期。在水產養(yǎng)殖相關生產過程中一般使用快速生長期階段的微藻作為餌料或加工原材料，從而保證其數量和質量。微藻生長過程的監(jiān)測一般使用血球計數板技術檢測細胞數，但這對生產者有一定的技術要求，如需掌握血球計數板、顯微鏡等操作方法，因此在實際生產過程中大部分養(yǎng)殖戶僅通過肉眼觀察藻液顏色變化來初步判斷微藻的生長情況，但用人體感官判斷顏色變化會受到操作者主觀性的影響，存在隨意性，不同評判者由于個體視覺差異對同一顏色的特征區(qū)分會存在一定偏差，無法滿足現代農業(yè)生產對精準化的要求。因此有必要在利用顏色體系對微藻的生長情況進行定性描述的同時開展定量研究，尤其是量化顏色參數。

國內外顏色的量化分析研究在眾多行業(yè)早已得到廣泛應用，主要利用色差計開展。色差計是利用儀器內部的標準光源照明被測物體，測定其CIEL*a*b*值。CIE1976 中L*、a*、b*推薦的表色系具有均勻的顏色空間，與人的視覺相一致，其中顏色指標L*代表明度值；a*(?A～+A) 代表紅度值，表示從綠到紅的變化，其正值越大，綠色越淡，紅色愈濃；b*(?B～+B) 代表黃度值，表示從藍到黃的變化，其正值越大，黃色越濃[11-13]。目前尚未見顏色的量化分析在微藻養(yǎng)殖上的應用，因此，本研究以色度學理論為前提，利用色差儀對熱帶普通小球藻生長過程中的顏色動態(tài)分析進行色度學指標量化測定，分析顏色參數與色素質量濃度間的關系，以期為建立小球藻生長狀況快速檢測技術奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種及培養(yǎng)

實驗所用熱帶普通小球藻取自海南大學海洋學院保種室。實驗前將藻種進行純化擴培，取快速生長期的藻液進行實驗。實驗溫度維持在 (25±1) ℃，光照強度控制在5 000 lx，光周期為24 h 全光照。使用過濾并滅菌的自然海水及“寧波3#微藻培養(yǎng)液”在5 L 三角錐形瓶中進行5 L 體積藻液的培養(yǎng)，用帶有2 μm 孔徑空氣過濾器的充氧泵進行連續(xù)充氣，充氣量為20 L·min?1。藻細胞培養(yǎng)接種量為5×104個·mL?1。

1.2 實驗設計

設置5 個平行培養(yǎng)組，以接入藻種與培養(yǎng)介質充分混合后為時間起點，每隔24 h 進行取樣，取樣前將培養(yǎng)瓶中的藻液搖勻，取一定量樣品檢測藻類細胞數目、干質量、色素質量濃度、顏色，操作重復3 次。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 藻細胞數目的測定 采用血球計數板法進行測定。

1.3.2 光合色素質量濃度及比值測定 在弱光條件下用丙酮萃取法萃取樣品色素后，用三波長比色法[14]在分光光度計島津UV-1 700 上進行提取液的光吸收值檢測，計算葉綠素a(Chl-a)、葉綠素b(Chl-b)、總葉綠素 (Chl) 和類胡蘿卜素 (Caro) 的質量濃度，并計算類葉比 (Caro/Chl)。

1.3.3 顏色參數測定 采用CM-5 型號的全自動分光測色儀 (Konica Minolta,日本) 測定藻液樣品的顏色參數，測定的色度學指標主要包括L*、a*、b*、相角 (H°)、飽和度 (C) 和色差值 (ΔE)。以相同的無藻培養(yǎng)水體作為對照值，分別測得L*、a*和b*，并計算H°、C和ΔE。計算公式為H°=arctan (b*/a*)；C=(a*2+b*2)1/2；ΔE=(ΔL*2+Δa*2+b*2)1/2。

1.4 數據處理

2 結果

2.1 熱帶普通小球藻的生長過程及階段劃分

熱帶普通小球藻在養(yǎng)殖周期10 d 內，細胞數整體趨勢為先緩慢增長后快速增長，隨后呈穩(wěn)定狀態(tài)，最后開始降低，可分為接種期、快速生長期、穩(wěn)定期和衰亡期 (圖1)。接種密度為 (6.13±1.01)×104個·mL?1，在養(yǎng)殖第1 天后進入快速生長期[(32.20±4.15)×104個·mL?1]，并在第4 天達到最高[(732.12±39.44)×104個·mL?1]，隨后進入穩(wěn)定期 [第5 至第9 天，平均密度為 (664.12±18.73)×104個·mL?1]，在第10 天藻細胞數目出現顯著性下降，進入衰亡期，呈快速降低趨勢 (細胞數<600×104個·mL?1，P<0.05)。

圖1 熱帶普通小球藻生長過程中細胞數變化及階段劃分不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)；后圖同此Figure 1 Change of cell density and growth phase division of C.vulgaris in process of growthDifferent lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).The same case in the following figures.

2.2 熱帶普通小球藻生長過程中顏色特征值的動態(tài)變化

2.2.1L*、a*、b*變化特征 熱帶普通小球藻在養(yǎng)殖周期10 d 內，L*和a*隨生長階段的推進基本呈逐漸降低趨勢，而b*呈逐漸升高趨勢 (圖2)。其中L*在養(yǎng)殖第3 天由103.04±0.01 顯著降至98.70±0.38 (P<0.05)，隨后逐步平緩下降；a*朝負值方向發(fā)展，在養(yǎng)殖第2 天由?0.51±0.01 顯著降至?2.08±0.06 (P<0.05)；b*在養(yǎng)殖第2 天由0.58±0.03 顯著升至7.40±0.21 (P<0.05)，隨后快速穩(wěn)定升高。

2.2.2H°、△E和C變化特征 熱帶普通小球藻在養(yǎng)殖周期10 d 內，△E和C隨生長階段的推進基本呈穩(wěn)定上升趨勢，而H°則呈逐漸降低趨勢(圖3)。其中H°呈負值變化趨勢，在養(yǎng)殖第1 天由?0.84±0.02 顯著降至?1.23±0.02，隨后平穩(wěn)小幅度變化；△E在養(yǎng)殖第2 天由0.66±0.01 顯著升至7.14±0.22 (P<0.05)，然后隨著養(yǎng)殖時間而穩(wěn)健增長；C的變化趨勢與△E相同，養(yǎng)殖第2 天由0.77±0.02 升至7.68±0.21 (P<0.05)，隨后穩(wěn)健增長。

2.3 熱帶普通小球藻生長過程中色素成分質量濃度和Caro/Chl 的動態(tài)變化

2.3.1 綠色素變化特征 在養(yǎng)殖周期10 d 內，熱帶普通小球藻綠色素 (Chl-a、Chl-b和總葉綠素) 質量濃度變化整體呈先快速增長后降低的趨勢 (圖4)。養(yǎng)殖第1 天后綠色素質量濃度開始快速增長，養(yǎng)殖第5 天Chl-a、Chl-b和總葉綠素質量濃度分別顯著增加至 (0.57±0.05) mg·L?1、(0.24±0.04) mg·L?1和 (0.81±0.08) mg·L?1(P<0.05)；隨后緩慢增長，并在養(yǎng)殖第9 天達最大值，Chl-a、Chl-b和總葉綠素質量濃度分別為 (1.03±0.12) mg·L?1、(0.36±0.07)mg·L?1和 (1.38±0.20) mg·L?1，隨后開始下降。

2.3.2 Caro 的動態(tài)變化 在養(yǎng)殖周期10 d 內，熱帶普通小球藻Caro 質量濃度變化趨勢與綠色素相同，整體呈先快速增長后降低的趨勢 (圖5)。養(yǎng)殖第1 天后其質量濃度開始快速增長，在第5 天顯著增至 (0.52±0.05) mg·L?1(P<0.05)，并在第9 天達最大值(1.14±0.15) mg·L?1，隨后開始顯著快速降低 (P<0.05)。

圖2 熱帶普通小球藻生長過程中明度值 (A)、紅度值 (B)和黃度值 (C) 的變化Figure 2 Change of lightness value (A),red value (B) and yellow value (C) of C.vulgaris in process of growth

圖3 熱帶普通小球藻生長過程中相角 (A)、色差值 (B) 和飽和度 (C) 的變化Figure 3 Change of hue angle (A),color difference (B) and chroma (C) of C.vulgaris in process of growth

圖4 熱帶普通小球藻生長過程中葉綠素a (A)、葉綠素b(B) 和總葉綠素 (C) 質量濃度的變化Figure 4 Change of Chl-a (A),Chl-b (B) and chlorophyll (C)mass concentrations of C.vulgaris in process of growth

圖5 熱帶普通小球藻生長過程中類胡蘿卜素質量濃度的變化Figure 5 Change of carotenoid mass concentration of C.vulgaris in process of growth

2.3.3 Caro/Chl 的動態(tài)變化 在養(yǎng)殖周期10 d內，隨生長階段的推進熱帶普通小球藻的Caro/Chl 呈不斷增大趨勢 (圖6)。養(yǎng)殖第3 天顯著增至0.58±0.13 (P<0.05)，隨后基本穩(wěn)定在0.74～0.82，養(yǎng)殖第10 天升至1.10±0.14 (P<0.05)。

圖6 熱帶普通小球藻生長過程中類葉比值的變化Figure 6 Change of ratio of carotenoid and chlorophyll of C.vulgaris in process of growth

2.4 熱帶普通小球藻生長過程中細胞密度、色素參數與顏色特征值的相關分析

在養(yǎng)殖周期10 d 內，熱帶普通小球藻的細胞密度、色素參數與L*、a*、H°均呈負相關，與b*、△E、C呈極顯著正相關 (表1)。細胞密度與L*呈極顯著負相關 (P<0.05)，與其他顏色參數特征值呈極顯著相關 (P<0.01)；Caro/Chl 與H°呈極顯著負相關 (P<0.01)，而其他色素成分 (Chl-a、Chlb、總葉綠素、Caro) 質量濃度與H°呈顯著負相關(P<0.05)；色素成分質量濃度均與L*和a*呈極顯著負相關 (P<0.01)。熱帶普通小球藻生長過程中，其色素成分質量濃度和Caro/Chl與L*、a*、b*、△E、C的相關系數絕對值介于0.91～0.98，而與H°的相關系數絕對值介于0.64～0.77。L*、a*、b*、△E、C與色素成分質量濃度、Caro/Chl 之間的相關性相對更高、更密切。

表1 熱帶普通小球藻生長過程中顏色參數與細胞密度、色素參數質量濃度的簡單相關分析Table 1 Simple correlation analysis among color parameters and cell density,pigment contents of C.vulgaris in process of growth

2.5 熱帶普通小球藻生長過程中細胞密度、色素參數與顏色特征值的線性回歸分析

在養(yǎng)殖周期10 d 內，熱帶普通小球藻L*、a*、b*、△E與細胞密度、綠色素、Caro、總色素質量濃度均具有顯著線性相關關系 (P<0.05，表2)。其中Xa的回歸系數絕對值最大；不同變量中的決定系數均大于0.90 (R2>0.90)，代表回歸方程擬合度較高，其中Caro 最高 (R2=0.973 1)，其次為細胞密度值 (R2=0.971 6)，而Chl-a最小 (R2=0.914 0)。

表2 熱帶普通小球藻生長過程中細胞密度、色素參數質量濃度與顏色參數的回歸分析Table 2 Analysis of regression among cell density,pigment contents and color parameters of C.vulgaris in process of growth

3 討論

微藻的培養(yǎng)按規(guī)?？煞譃橐患壉７N培養(yǎng)、二級中等擴培和三級大規(guī)模培養(yǎng)；按培養(yǎng)系統可分為開放式培養(yǎng)系統 (開發(fā)最早、應用最為普遍)、半封閉式培養(yǎng)系統、封閉式培養(yǎng)系統 (較為現代化)。其中封閉式培養(yǎng)系統包含管道式生物反應器、機械攪拌式生物反應器、平板式光生物反應器、鼓泡式光生物反應器、氣升式光生物反應器、浮式薄膜袋光生物反應器等多種形式，具有能夠有效控制培養(yǎng)條件、控制污染、實現純種培養(yǎng)、營養(yǎng)鹽損失小等特點[1]。本研究所采用的培養(yǎng)方式是建立在二級中等擴培基礎上的鼓泡式，嚴格控制接種量、營養(yǎng)鹽水平和光照強度，因此研究結果可為后期熱帶普通小球藻的規(guī)?；囵B(yǎng)提供可靠基礎數據。微藻的培養(yǎng)生長周期可簡單概括為接種期、快速生長期 (指數生長期)、穩(wěn)定期和衰亡期，本研究條件下熱帶普通小球藻在養(yǎng)殖周期10 d 內符合該生長規(guī)律，在養(yǎng)殖第2 天便進入快速生長期，在第4 天接近最大生長值，是連續(xù)培養(yǎng)中作為生物餌料使用時的最佳采收時期，這與丁麗歡等[8]、葸玉琴等[15]的研究結果較為一致。

感官技術是把人作為精密測量儀器對產品進行感官檢驗的科學方法，如將視覺、觸覺、嗅覺、味覺和聽覺用于產品的測量和分析[16]，但這種技術主觀隨意性大，會受到技術人員的認識程度等諸多因素的影響，從而難以滿足精準化生產操作的要求[12]。微藻養(yǎng)殖過程中顏色的變化是其生理變化的宏觀體現，也是確定采收及使用時間的主要外觀指標之一。本研究在色度學理論基礎上，利用色差儀對熱帶普通小球藻生長過程中的顏色變化進行指標量化測定，并分析了顏色變化與藻細胞濃度、色素質量濃度的相關關系，可提高養(yǎng)殖監(jiān)測的科學性和準確性。本研究表明，在熱帶普通小球藻生長過程中，養(yǎng)殖水體顏色變化與藻類細胞密度和色素質量濃度變化規(guī)律具有較強的相關性 (相關系數在0.95 以上)，具有規(guī)律性，因此可以通過測定顏色參數值來判定熱帶普通小球藻密度及色素質量，具有快速、準確、科學的特點。這與孟凡娟等[17]、Timothy 等[18]對番茄 (Solanum lycopersicum)、蔡鴻昌等[19]對黃瓜 (Cucumis sativusL.) 初花期葉片，以及于國鋒等[20]對煙葉顏色的研究結果相似，因此顏色變化可應用于生物量與質的快速評價。

植物的顏色是其最顯著的表觀性狀，取決于其所含色素種類、含量及相對含量，而色素的相對含量與種類、生長狀態(tài)、生長條件等密切相關。色素是植物光合作用的基礎，其濃度高低可反映植物功能的強弱[21-22]。熱帶普通小球藻生長過程中，綠色素 (Chl-a、Chl-b、總葉綠素) 和Caro 在快速生長期呈線性增長趨勢，這與b*和△E變化趨勢相似，因此可將b*和△E作為熱帶普通小球藻生長進程和色素質量的判斷指標。此外，本研究通過建立線性回歸方程，把熱帶普通小球藻生長過程中細胞密度、色素總含量與顏色參數值聯系起來，從而通過無損失、無損傷的顏色參數值的變化來反映熱帶普通小球藻的生長情況和質量，達到了無接觸性判斷的目的，在一定程度上保障其不會因取樣、檢測等操作而被污染。在熱帶普通小球藻生長過程中總葉綠素、Caro、總色素質量濃度和b*、△E和C均呈增加趨勢，而L*、a*、H°呈降低趨勢。L*、a*、b*、△E與細胞數及色素質量濃度的線性回歸模型擬合度較高，均達極顯著水平，今后應在不同條件下對模型進行進一步驗證和修正，使其具有更廣泛的適用性和普遍的指導意義。

4 結論

綜上，顏色參數值b*和△E的變化可有效指示熱帶普通小球藻生長過程中細胞密度及色素質量濃度的變化，特別是在快速生長期更為靈敏，可作為較佳的指示指標。該法可在一定程度上對微藻養(yǎng)殖過程進行非接觸性動態(tài)變化監(jiān)測，并為實現實時監(jiān)測的定量化提供理論依據，具有快速、準確、科學的特點；然而，不同品種之間可能存在顯著差異，因此需對在不同品種上的應用進行進一步實驗和驗證，從而提高該法應用的廣泛性。