孫彩云 ，董宏標(biāo), ，王文豪 ，李 勇，古群紅，段亞飛,，張家松,，許曉東

（1.水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 (上海海洋大學(xué))，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地，廣東 深圳 518121；4.珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，廣東 珠海 519070；5.珠海德洋水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，廣東 珠海 519000）

花鱸 (Lateolabrax maculatus) 又稱海鱸、七星鱸等，廣泛分布于中國(guó)沿海地區(qū)。因其生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、肉質(zhì)鮮美，兼具廣鹽、廣溫性，深受養(yǎng)殖戶喜愛，是中國(guó)海水魚養(yǎng)殖的主要種類之一[1-3]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的持續(xù)擴(kuò)大，生產(chǎn)上愈發(fā)追求低成本高產(chǎn)出，而高密度、投餌過度、飼料能量過高或變質(zhì)等會(huì)造成魚類脂質(zhì)代謝障礙，機(jī)體抗氧化能力和免疫力下降，脂肪肝誘發(fā)幾率大大增加，影響生產(chǎn)性能和水產(chǎn)品品質(zhì)，制約花鱸養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[4-5]。

月桂酸單甘油酯 (Glycerol monolaurate,GML)又稱十二酸單甘油酯，屬于中鏈脂肪酸 (Mediumchainfatty acids,MCFAs)，天然存在于母乳、椰子油和美洲蒲葵中，也可通過直接酯化來源于天然油脂的月桂酸和甘油得到，具有乳化和防腐雙重功能，還具有抗菌、抗病毒等多種生物學(xué)特性，是美國(guó)食品與藥物管理局 (FDA) 和中國(guó)均已批準(zhǔn)使用的食品和飼料添加劑[6]。GML 用作食品添加劑主要起到防腐保鮮的作用；用作畜禽飼料添加劑，可起到加快生長(zhǎng)速度、提高抗病性以及促進(jìn)動(dòng)物肝臟脂肪酸氧化、脂質(zhì)代謝和改善肌肉品質(zhì)等作用[7-10]。

目前，GML 雖然在畜禽養(yǎng)殖中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但在養(yǎng)殖魚類中研究較少，而在花鱸養(yǎng)殖中應(yīng)用的研究尚未見報(bào)道。本文以花鱸為研究對(duì)象，通過拌喂不同劑量的GML，探討其對(duì)花鱸臟器系數(shù)、肝臟組織形態(tài)、血清生化指標(biāo)、抗氧化能力以及脂質(zhì)代謝的影響，以期為GML 作為綠色添加劑在花鱸飼料中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，亦可為魚類脂肪肝改善提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 飼料制備

實(shí)驗(yàn)所用GML 購(gòu)自廣東省脂類科學(xué)與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心。將GML 用無水乙醇溶解后，分別以0、1 000、2 000 和4 000 mg·kg?1的添加量與基礎(chǔ)飼料均勻混合，自然風(fēng)干后備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

本實(shí)驗(yàn)所用花鱸購(gòu)自珠海市當(dāng)?shù)啬仇B(yǎng)殖場(chǎng)，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)于珠海德洋水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司的室外水泥養(yǎng)殖池內(nèi)的圍隔網(wǎng)箱 (1.5 m×1.2 m×1.0 m) 中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開始前將花鱸置于室內(nèi)方形水泥池 (4 m×2.5 m×1 m) 中暫養(yǎng)14 d，暫養(yǎng)期間每天08:00 和18:00 飽食投喂2 次鱸魚配合飼料 (珠海海龍生物飼料有限公司)。暫養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)選取體表無損傷、規(guī)格相近、平均體質(zhì)量為 (230±20) g 的花鱸共320 尾，分為4 組，每組4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為一個(gè)網(wǎng)箱，每個(gè)網(wǎng)箱放養(yǎng)20 尾。各實(shí)驗(yàn)組按對(duì)應(yīng)飼料投喂，養(yǎng)殖8 周，每天08:00 和18:00 飽食投喂2 次，實(shí)驗(yàn)期間水溫 (28±2) ℃，pH 7.6～8.2，溶解氧質(zhì)量濃度大于6.0 mg·L?1，自然光周期。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期間，分別在第0、第2、第4、第8 周取樣。每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)魚饑餓24 h，每個(gè)重復(fù)組隨機(jī)撈取1 尾實(shí)驗(yàn)魚，合計(jì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組共4 尾。實(shí)驗(yàn)魚在200 mg·L?1的MS-222 中迅速麻醉后，測(cè)量體質(zhì)量、體長(zhǎng)，1.5 mL 無菌注射器尾靜脈取血，取全血樣品在4 ℃下靜置1 h，待血液分層后，以3 000 r·min?1離心10 min，最后收集血清于1.5 mL 離心管，?80 ℃保存?zhèn)溆?。采血后，置于冰盤上解剖，分別稱量?jī)?nèi)臟團(tuán)、肝臟和腹脂質(zhì)量，取肝臟于2 mL 離心管中，?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.4.1 臟器系數(shù)計(jì)算 根據(jù)以下公式計(jì)算腹脂率(Intraperitoneal fat ratio,IPF)、肝體比 (Hepatosomatic index,HSI)、肥滿度 (Condition factor,CF) 和臟體比 (Viscerosomatic index,VSI)。

式中W為魚體質(zhì)量 (g)；Wi為腹脂質(zhì)量 (g)；Wh為肝臟質(zhì)量 (g)；Wv為魚內(nèi)臟團(tuán)質(zhì)量 (g)；L為體長(zhǎng) (cm)。

1.4.2 肝臟組織切片制備及觀察 肝臟組織切片的制作與觀察參照區(qū)又君等[11]的方法進(jìn)行，主要步驟為：將麻醉后的實(shí)驗(yàn)魚解剖，取出肝臟后用0.86% 的生理鹽水沖洗干凈，取肝臟一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 以上。制作切片前取出，經(jīng)過流水沖洗、70%～100%的乙醇脫水和二甲苯透明，經(jīng)石蠟包埋處理后，連續(xù)切片，切片厚度為5～6 μm，進(jìn)行HE 染色和中性樹脂封片，室溫風(fēng)干，于顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.3 血清生化指標(biāo)測(cè)定 采用全自動(dòng)生化分析儀 (BS200) 測(cè)定血清中總膽固醇 (TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (AST)，均用商業(yè)試劑盒 (深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司) 檢測(cè)。

1.4.4 肝臟抗氧化指標(biāo)和脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 肝臟中超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、脂肪酸合成酶 (FAS)、乙酰輔酶A 羧化酶 (ACC)、脂蛋白脂酶 (LPL)、還原型谷胱甘肽(GSH) 和丙二醛 (MDA) 等的測(cè)定均采用商業(yè)試劑盒 (南京建成生物工程研究所，中國(guó))，測(cè)定方法依照說明書。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果

2.1 飼料中添加GML 對(duì)花鱸臟器系數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，各處理組肝體比在第4 周均顯著降低，低劑量組顯著低于其他組 (P<0.05)；處理組的腹脂率均顯著低于對(duì)照組，其中，中劑量組降低最明顯 (P<0.05，圖1)；飼料中添加GML 的水平對(duì)花鱸肥滿度和臟體比的影響不顯著 (P<0.05)。

2.2 飼料中添加GML 對(duì)花鱸肝臟組織形態(tài)的影響

觀察圖2 (第4 周) 和圖3 (第8 周) 肝臟組織學(xué)切片發(fā)現(xiàn)，各組肝細(xì)胞內(nèi)均有大小不一的脂肪滴，對(duì)照組由于肝細(xì)胞被脂肪滴充斥，細(xì)胞呈透明空泡化，且細(xì)胞核被擠壓到一側(cè)，發(fā)生核偏移；各GML 添加組花鱸肝臟細(xì)胞中脂滴減少，脂肪空泡化明顯減輕，脂質(zhì)沉積現(xiàn)象有所緩解，且以中劑量組效果最明顯。

2.3 飼料中添加GML 對(duì)花鱸血清學(xué)指標(biāo)的影響

與對(duì)照組相比，第4 和第8 周各處理組TG 的濃度顯著降低 (P<0.05，圖4)；第4 周各處理組TC 濃度顯著低于對(duì)照組 (P<0.05)；低劑量組和中劑量組LDL-C 和ALT 均有明顯降低 (P<0.05)；而HDL-C 濃度在第4 周出現(xiàn)顯著性升高，且中劑量組要顯著高于其他組 (P<0.05)；中劑量組第8 周AST 活性降低最明顯 (P<0.05)。

2.4 飼料中添加GML 對(duì)花鱸抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

拌喂GML 后，各GML 添加組花鱸肝臟中GSH-Px 活性在第2 和第4 周均有明顯升高 (P<0.05，圖5)；SOD 活性和GSH 濃度在第4 和第8 周較對(duì)照組均有顯著上升 (P<0.05)；而MDA 濃度較對(duì)照組均顯著降低，且在第4 周中劑量組顯著低于其他組 (P<0.05)。

2.5 飼料中添加GML 對(duì)花鱸脂質(zhì)代謝的影響

與對(duì)照組相比，拌喂GML組花鱸FAS 和ACC活性均有降低，且各GML添加組間無明顯差異(P<0.05，圖6)；而各處理組LPL 活性均顯著升高，且中劑量組顯著高于其他組 (P<0.05)。

3 討論

3.1 GML 對(duì)花鱸臟器系數(shù)的影響

圖1 飼料中添加月桂酸單甘油酯對(duì)花鱸臟器系數(shù)的影響相同采樣點(diǎn)上標(biāo)字母不同表示差異顯著 (P<0.05)；圖4、圖5、圖6 同此Figure 1 Effects of dietary GML level on organ coefficients of L.maculatusValues with different superscript letters for the same time are significantly different (P<0.05).The same case in Figure 4,Figure 5 and Figure 6 .

圖2 第4周飼料中添加月桂酸單甘油酯對(duì)花鱸肝臟組織形態(tài)的影響 (10×40 倍)a.對(duì)照組；b.低劑量組；c.中劑量組；d.高劑量組；FD.脂肪滴；N.細(xì)胞核；圖3 同此Figure 2 Effects of dietary GML level on liver histological structure of L.maculatus in 4th week (10×40 times)a.Control group;b.Low-dose group;c.Medium-dose group;d.High-dose group;FD.Fat dripping;N.Nucleus.The same case in Figure 3.

圖3 第8周飼料中添加月桂酸單甘油酯對(duì)花鱸肝臟組織形態(tài)的影響 (10×40 倍)Figure 3 Effects of dietary GML level on liver histological structure of L.maculatus in 8th week (10×40 times)

在高密度集約化養(yǎng)殖條件下，低蛋白和高脂肪水平配合飼料的大量使用，導(dǎo)致魚體脂肪極易蓄積[12]。魚類體脂沉積主要集中于肝臟、腹腔和肌肉等部位，而腹腔脂肪大量蓄積會(huì)影響魚類營(yíng)養(yǎng)代謝、降低生產(chǎn)性能和免疫力，導(dǎo)致疾病爆發(fā)，乃至引發(fā)魚體大量死亡[13]。本研究拌喂GML 后，花鱸腹脂率均顯著降低，肝體比第4 周降低明顯，表明適量拌喂GML 可有效減少花鱸肝臟和腹腔脂肪的蓄積。這與劉夢(mèng)蕓等[14]和Belghit 等[15]的研究結(jié)果類似，他們發(fā)現(xiàn)飼料中添加GML 可降低蛋雞腹脂率和大西洋鮭 (Salmo salar) 的肝臟脂肪含量。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在公牛飼糧中加入椰子油 (椰子油是最重要的月桂酸類油脂，在機(jī)體消化吸收過程中可形成GML)，也類似的顯著降低了胴體質(zhì)量和體脂含量[16-17]。本研究結(jié)果與之相似，飼料中添加GML 可促進(jìn)花鱸脂質(zhì)的快速氧化，減少脂肪蓄積，改善魚體品質(zhì)。

3.2 GML 對(duì)花鱸血清學(xué)指標(biāo)的影響

魚類血清生化指標(biāo)與機(jī)體代謝、營(yíng)養(yǎng)水平及疾病聯(lián)系密切，可以較好地反映魚體的生理代謝情況，也是衡量其健康水平的重要檢測(cè)指標(biāo)[18]。由于脂質(zhì)在體內(nèi)的運(yùn)輸主要借助于血液，所以血清中TC 和TG 的濃度可在一定程度上反映機(jī)體脂質(zhì)代謝程度[19-20]。脂質(zhì)在運(yùn)輸時(shí)，需要以脂蛋白為載體，通過HDL-C 和LDL-C 等形式在肝臟和血液之間轉(zhuǎn)運(yùn)[21]。血清中HDL-C 的降低或者LDL-C 的升高，都將影響肝臟正常脂質(zhì)代謝[22]。本實(shí)驗(yàn)中GML 添加組血清TG、TC 和LDL-C 濃度均隨GML添加水平的升高而降低，與對(duì)照組相比，HDLC 濃度則顯著升高，說明GML 可能是通過降低LDL-C 的濃度來影響脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程，進(jìn)而降低血清中TG 和TC 的濃度。這與Zhao 等[23]、劉夢(mèng)蕓等[9]和汪愈超等[6]的研究結(jié)果類似，他們發(fā)現(xiàn)飼料中添加GML 可以降低血清TG 和TC 水平。Wang和Kim[24]的研究結(jié)果與之相似，隨著肉雞飼糧中椰子油替代豆油的比例不斷升高，血清中TC、LDL-C 的水平呈下降趨勢(shì)。但蔣增良[25]報(bào)道，在小鼠日糧中加入低劑量的GML，增加了腹部脂肪、血清TG 濃度和LDL-C 濃度，并顯著降低了HDL-C 濃度，高劑量卻可以緩和這種不良效應(yīng)。因此，GML 的添加量可以顯著影響血清學(xué)指標(biāo)的變化，適宜添加量的GML 能顯著降低血脂，改善花鱸血清脂質(zhì)代謝。

ALT 和AST 是反映機(jī)體肝功能的兩個(gè)敏感指標(biāo)。當(dāng)肝臟受到各種因素的損害時(shí)，肝細(xì)胞通透性增加，ALT 和AST 就會(huì)滲透進(jìn)入血液，導(dǎo)致血清中兩者濃度增加[26]。因此，血清中ALT和AST 活性升高可表明其肝功能存在一定程度損傷。本實(shí)驗(yàn)中，拌喂GML 可以顯著降低花鱸血清中ALT 和AST 活性，這與類似研究中添加GML 對(duì)蛋雞的研究結(jié)果一致[14]。郭錫欽[27]報(bào)道，GML 在進(jìn)入機(jī)體后，到達(dá)腸道被脂肪酶分解成月桂酸和甘油，最終在肝臟中被分解成二氧化碳和水，說明GML 不但對(duì)肝臟無毒副作用，還能明顯改善花鱸的肝功能。但Wieland 等[28]在對(duì)初生奶牛的研究中卻發(fā)現(xiàn)將栗子和GML 加入飼糧中，血清中AST 的活性無顯著變化。筆者認(rèn)為，出現(xiàn)上述差異的原因極大可能與GML 添加量有關(guān)。目前關(guān)于GML 對(duì)血清和肝功能影響的研究較少，其具體影響機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。

圖4 飼料中添加月桂酸單甘油酯對(duì)花鱸血清學(xué)指標(biāo)的影響Figure 4 Effects of dietary GML level on serum biochemical indices of L.maculatus

3.3 GML 對(duì)花鱸抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

需氧生物在脂質(zhì)代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量自由基，這也是機(jī)體過氧化損傷、代謝紊亂和抗氧化失衡的主要因素之一[29-30]。自由基的清除是機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng) (包括抗氧化酶系統(tǒng)和非抗氧化酶系統(tǒng))在發(fā)揮功能[31]。SOD 和GSH-Px 屬于抗氧化酶系統(tǒng)，與清除自由基功能密切相關(guān)，能保護(hù)重要的細(xì)胞大分子和細(xì)胞器免受氧化損傷；還原型谷胱甘肽屬于非抗氧化酶系，作為GSH-Px 的反應(yīng)底物，既參與GSH-Px 清除自由基途徑，又直接與生物體內(nèi)的氧自由基結(jié)合[32-33]。兩者濃度升高可以有效緩解機(jī)體自由基生成和脂質(zhì)過氧化，是體內(nèi)酶促抗氧化體系的重要組成[34]。MDA 是自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物，其濃度高低反映細(xì)胞受損程度[35-36]。劉夢(mèng)蕓等[14]在GML 對(duì)蛋雞抗氧化能力的影響研究中發(fā)現(xiàn)，GML 可以顯著提高血清SOD 活性和GSHPx 濃度，并顯著降低MDA 濃度。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果類似，拌喂GML 可以使花鱸肝臟中的SOD、GSH-Px 和GSH 水平顯著升高，MDA 濃度顯著降低。動(dòng)物體在應(yīng)激狀態(tài)下，抗氧化酶活性降低，氧化代謝產(chǎn)物積累，機(jī)體自由基產(chǎn)生與清除失衡，從而引發(fā)氧化損傷。GML提高機(jī)體抗氧化能力的原因可能是：作為中鏈脂肪酸，GML 可以為花鱸供能，使得其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝耗能減少，線粒體產(chǎn)能和自由基生成量減少，機(jī)體氧化應(yīng)激程度減輕，抗氧化能力得到恢復(fù)[37]。然而，尹彩娜等[38]研究表明，在小鼠日糧中添加椰子油能顯著提高小鼠血清MDA 濃度，同時(shí)降低SOD 活性。導(dǎo)致以上研究結(jié)果不一致的原因可能與GML 的添加形式、添加量和實(shí)驗(yàn)對(duì)象種類不同有關(guān)。

圖5 飼料中添加月桂酸單甘油酯對(duì)花鱸抗氧化能力的影響Figure 5 Effects of dietary GML level on liver hepatic antioxidative ability of L.maculatus

3.4 GML 對(duì)花鱸脂質(zhì)代謝和肝臟組織形態(tài)的影響

肝臟是魚類脂質(zhì)代謝的主要場(chǎng)所，脂肪合成、分解、轉(zhuǎn)運(yùn)等代謝過程均在其中完成。肝臟中，F(xiàn)AS、ACC 和LPL 等的活性可以反映機(jī)體脂質(zhì)代謝水平[39-40]。FAS 和ACC 是魚類肝臟中脂肪酸合成代謝的關(guān)鍵酶，ACC 催化乙酰COA 形成丙二酰COA，F(xiàn)AS 催化乙酰COA 和丙二酰COA 合成脂肪酸，兩者的高低可以反映機(jī)體脂肪酸的合成速度[41]。LPL 是脂質(zhì)代謝過程中的關(guān)鍵限速酶，可以將血液中的乳糜微粒、極低密度脂蛋白中的TG分解為游離脂肪酸和甘油，從而降低血液中TC 水平[42]。以往研究表明，GML 可以提高脂質(zhì)代謝酶活性，減少脂質(zhì)沉積，改善脂質(zhì)代謝。隨著肉雞飼糧中椰子油添加水平的升高，血清脂蛋白酯酶、肝酯酶和總脂肪酶活性均呈線性增加；在公牛飼料中添加椰子油，可增加其脂肪積累所需的時(shí)間；在斷奶仔豬的日糧中同時(shí)添加椰子油和0.4%的GML，可顯著改善其脂質(zhì)代謝，且前期優(yōu)于后期[24,43-44]。本研究結(jié)果與上述相似，GML 添加組花鱸肝臟FAS和ACC 活性下降，而LPL 活性顯著增高，說明GML 提高了肝臟脂肪分解代謝酶活性，降低了脂肪合成酶水平，能夠促進(jìn)脂質(zhì)代謝。結(jié)合肝臟組織形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組肝臟中具有嚴(yán)重的脂質(zhì)沉積和肝細(xì)胞空泡化現(xiàn)象，與之相比GML 添加組狀況均有減輕，說明GML 確實(shí)具有一定的緩解脂質(zhì)沉積的效果。此外，有研究表明持續(xù)性投喂添加劑GML 的效果要優(yōu)于短期內(nèi)高劑量投喂[45]。因此，長(zhǎng)期投喂GML 是否能解決在養(yǎng)殖過程中脂肪肝的發(fā)生問題，仍需在后續(xù)研究中進(jìn)一步確認(rèn)。

圖6 飼料中添加月桂酸單甘油酯對(duì)花鱸脂質(zhì)代謝酶活性的影響Figure 6 Effects of dietary GML level on liver lipid metabolism enzymatic activity of L.maculatus

4 結(jié)論

在飼料中添加適量GML 能顯著減少花鱸肝臟和腹腔脂肪含量、促進(jìn)血清和肝臟脂質(zhì)代謝、提高抗氧化能力和肝功能，對(duì)改善花鱸健康狀況具有積極作用。在本實(shí)驗(yàn)條件下，GML 拌料量為2 000 mg·kg?1時(shí)，改善脂質(zhì)代謝效果最顯著。