鄭若曦 陳 俊 葉錦霞 鄭春松 趙錦燕 林 潔 吳廣文

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種多見于中老年人的骨關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增加，其特點(diǎn)是易反復(fù)發(fā)作，具有較高的致殘率，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1-2］。目前對(duì)KOA的治療主要有手術(shù)和保守治療［3-4］，但尚缺乏特效療法。研究證實(shí)，OA在多種因素共同影響下，最終出現(xiàn)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、軟骨下骨三者降解和合成正常偶聯(lián)失衡，是一種慢性關(guān)節(jié)疾病［5］。細(xì)胞凋亡是軟骨細(xì)胞的中心性特征，對(duì)軟骨破壞起著支配性的作用，是軟骨退行性改變的重要因素［6］。目前，作為表觀遺傳學(xué)的重要研究方向，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）在OA發(fā)生發(fā)展中的作用正在被逐步研究。LncRNA GAS5、H19、HOTAIR等在OA的發(fā)生發(fā)展過程中起著極其重要的作用，參與調(diào)節(jié)OA軟骨中軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)代謝平衡的調(diào)控［7-9］。獨(dú)活寄生湯出自孫思邈《備急千金要方》，長(zhǎng)期應(yīng)用于KOA的臨床治療，療效可靠［10］，但是否通過調(diào)節(jié)LncRNA GAS5／miR-21，尚不明確。因此，本研究以KOA大鼠動(dòng)物模型為研究對(duì)象，通過觀察獨(dú)活寄生湯對(duì)LncRNA GAS5／miR-21及下游相關(guān)調(diào)節(jié)因子 MMP-3、MMP-9、MMP-13 和 ADAMTS-5 的影響，探討?yīng)毣罴纳鷾泳徿浌羌?xì)胞外基質(zhì)降解的作用機(jī)制，為獨(dú)活寄生湯臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡SPF級(jí)SD大鼠66只，雄性，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。動(dòng)物處理方法符合中華人民共和國(guó)科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 獨(dú)活寄生湯藥物組成：獨(dú)活9 g，桑寄生 6 g，牛膝 6 g，杜仲 6 g，秦艽 6 g，防風(fēng) 6 g，肉桂 6 g，細(xì)辛 6 g，當(dāng)歸 6 g，川芎 6 g，熟地黃 6 g，芍藥 6 g，人參 6 g，茯苓 6 g，甘草 6 g；鹽酸氨基葡萄糖膠囊（香港澳美制藥廠），均購(gòu)于閩侯縣上街致誠(chéng)醫(yī)藥商店。

1.3 主要儀器與試劑 NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）；PCR儀（Bio-rad公司）；7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；TRIZOL、mirVanaTMmiRNA提取試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；PrimeScriptTMRT mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Mir-XTMmiRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒（日本Takara公司）；AceQqPCR SYBR Green Master Mix試劑盒（中國(guó)Vazyme公司）。

2 方 法

2.1 造模與干預(yù) 66只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組18只和造模組48只。參照課題組前期造模方法復(fù)制KOA大鼠模型［11］，術(shù)后連續(xù)3 d青霉素20萬U肌肉注射預(yù)防感染。術(shù)后2周，隨機(jī)抽取正常組、造模組大鼠各3只，拍攝膝MRI鑒定模型。鑒定結(jié)束后，抽簽法隨機(jī)分為3組，即模型組（15只）、獨(dú)活寄生湯臨床等效劑量組（治療組，15只）和鹽酸氨基葡萄糖膠囊組（西藥組，15只）。根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”換算［12］，正常組和模型組給予0.9%生理鹽水；治療組給予獨(dú)活寄生湯；西藥組給予鹽酸氨基葡萄糖膠囊，灌胃給藥12周。

2.2 取材 治療結(jié)束后，采用2%戊巴比妥鈉按2 mL／kg的劑量麻醉大鼠，切取右側(cè)脛骨平臺(tái)，置于-80℃超低溫冰箱保存，用于LncRNA GAS5、miR-21、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5 基因表達(dá)檢測(cè)。

2.3 Real-time PCR法檢測(cè)軟骨組織中LncRNA GAS5、miR-21、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5基因表達(dá)水平。

2.3.1 miRNA提取及Real-time PCR檢測(cè) 用液氮將各組軟骨組織粉碎研磨，取25 mg勻漿，用mirVanaTMmiRNA提取試劑盒提取總RNA，取1 μg的RNA，加入于冰上配置的反轉(zhuǎn)錄體系，在37℃60 min、85℃ 5 min、4℃保存的條件下，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，4℃暫存或-80℃保存。配置Real-time PCR 反應(yīng)體系，① U6 反應(yīng)體系：Mix（2×） 5 μL，ROX（50×）0.2 μL，U6 上下游引物各 0.4 μL，DEPC 水 2 μL，cDNA 2 μL；② miR-21 反應(yīng)體系：Mix（2×） 5 μL，ROX（50×） 0.2 μL，miR-21 引物 0.4 μL，mRQ3'Primer 0.4 μL，DEPC 水 2 μL，cDNA 2 μL，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 30 s，95 ℃變性 10 s，60℃退火 34 s，持續(xù) 40個(gè)循環(huán)，最后95℃15 s、60℃延伸1 min。擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行基因表達(dá)的差異分析，以U6為內(nèi)參，評(píng)估被測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)水平，△Ct值即（目的基因Ct值－內(nèi)參 Ct值），采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 miR-21 基因相對(duì)表達(dá)量。具體引物序列見表1。

表1 相關(guān)引物序列

2.3.2 LncRNA／mRNA提取及Real-time PCR檢測(cè)

用液氮將各組軟骨組織粉碎研磨，取25 mg勻漿，用Trizol法提取總 RNA，取 1 μg的總 RNA，加入反轉(zhuǎn)錄體系，在 37℃ 15 min、85℃ 5 s、4℃保存的條件下，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，4℃暫存或-80℃保存。配置 Real-time PCR 反應(yīng)體系：Mix（2×） 10 μL，ROX（50×） 0.4 μL，上下游引物各 0.4 μL，DEPC 水7.8 μL，cDNA 1 μL；擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性 10 min，95℃變性10s，60℃退火34 s，持續(xù)40個(gè)循環(huán)，最后95℃ 15 s、60℃延伸1 min。擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行基因表達(dá)的差異分析，以β-actin為內(nèi)參，評(píng)估被測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)水平，△Ct值即（目的基因Ct值－內(nèi)參Ct值），采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。具體引物序列見表1。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用（±s）表示，不符合正態(tài)分布以中位數(shù)（四分間距位）表示。符合正態(tài)分布的多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較，方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Games-Howell檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡情況 在干預(yù)過程中，模型組死亡2只，治療組死亡1只，西藥組死亡1只。

3.2 大鼠膝關(guān)節(jié)MRI結(jié)果 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［13］，正常組可見關(guān)節(jié)間隙正常，內(nèi)外側(cè)半月板結(jié)構(gòu)完整，股骨髁和脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)面平整；造模組內(nèi)側(cè)半月板缺如，關(guān)節(jié)間隙增寬，關(guān)節(jié)軟骨面不平整、局部缺損，關(guān)節(jié)腫脹積液明顯，表明本研究中采用改良Hulth法成功復(fù)制了大鼠KOA模型。

3.3 4組大鼠軟骨組織LncRNA GAS5、miR-21表達(dá)水平比較 見圖1。

圖1 4組大鼠軟骨組織LncRNA GAS5、miR-21基因表達(dá)情況

3.4 4組大鼠軟骨組織MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5 mRNA表達(dá)水平比較 見圖2。

圖2 4組大鼠軟骨組織MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5 mRNA表達(dá)水平比較

4 討論

KOA是一種慢性退行性疾病，軟骨組織內(nèi)既沒有神經(jīng)也沒有血管，所以自我修復(fù)很困難，軟骨細(xì)胞作為軟骨組織內(nèi)的唯一細(xì)胞，它的功能就顯得非常重要［14］。軟骨主要由軟骨細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)組成，對(duì)維持軟骨的完整性以及軟骨的負(fù)重功能具有重要作用。大量研究證實(shí)MMPs和ADAMTS在KOA的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解中起著關(guān)鍵作用［15-16］。

miRNAs是一種長(zhǎng)度約21～23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，可通過結(jié)合抑制、切割等多種方式對(duì)mRNA的翻譯造成影響，從而調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)［17］。 LncRNA 是一組長(zhǎng)度大于 200 nt的 RNA，它不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，但已證明參與細(xì)胞多種行為的調(diào)控，KOA的發(fā)生發(fā)展與LncRNA的關(guān)系十分密切［18］。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA GAS5 ／miR-21 表達(dá)的改變與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)代謝平衡密切相關(guān)［19-23］。過表達(dá)LncRNA GAS5可提高M(jìn)MPs的表達(dá)水平，如MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13 和 ADAMTS-4，LncRNA GAS5的上調(diào)抑制了miR-21的表達(dá)水平，miR-21-5p的表達(dá)水平與軟骨退變呈負(fù)相關(guān)，miR-21-5p的過表達(dá)在OA軟骨細(xì)胞中會(huì)上調(diào)collagenⅡ表達(dá)和下調(diào) ADAMTS-5、MMP13 表達(dá)［5，24］。 collagenⅡ與Aggrecan是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，能為組織提供拉伸、抗壓等作用，而MMPs和ADAMTS在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解中有重要作用，如MMP-3、MMP-13對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)CollagenⅡ具有極強(qiáng)的消化作用，Aggrecan可被ADAMTS降解，被認(rèn)為是 OA軟骨破壞的主要機(jī)制［15-16，25］。 總之LncRNA GAS5可以通過調(diào)節(jié)miR-21促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，對(duì)KOA的病理進(jìn)程有很大影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組中LncRNA GAS5表達(dá)較正常組高，miR-21表達(dá)較正常組低，而經(jīng)過獨(dú)活寄生湯和鹽酸氨基葡萄糖膠囊治療后，LncRNA GAS5表達(dá)降低，miR-21表達(dá)升高；另外，本研究還檢測(cè)了LncRNA GAS5／miR-21調(diào)控的與KOA密切相關(guān)的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組相比，模型組中MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5mRNA 表達(dá)上升，經(jīng)過獨(dú)活寄生湯和鹽酸氨基葡萄糖膠囊治療后 MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5 mRNA 表達(dá)明顯下降。綜上可知，獨(dú)活寄生湯可能通過調(diào)控LncRNA GAS5／miR-21，進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游相關(guān)調(diào)節(jié)因子 MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5 表達(dá)，從而延緩軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解，起到治療KOA的作用。