（河北省醫(yī)療器械與藥品包裝材料檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050227）

0 引言

甲磺酸萘莫司他（Nafamostatemesilate，1,圖1a），化學(xué)名：6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯二甲磺酸鹽，分子量：539.58，是一種非肽類(lèi)合成蛋白酶抑制劑，用于治療胰腺炎、急性惡化的慢性胰腺炎，還用于血液透析，冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)，肝臟切除術(shù)時(shí)的抗凝[1-6]。腎小球腎炎伴系統(tǒng)性紅斑狼瘡或混合型冷球蛋白血癥，還用于體外膜式氧合。臨床劑型為凍干粉針注射劑。1由中間體對(duì)胍基苯甲酸鹽酸鹽和6-脒基-2-萘酚甲磺酸鹽(3)酯化、成鹽制得[7]。在研究中發(fā)現(xiàn)1化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，水、酸、堿、熱、光均會(huì)使樣品發(fā)生降解，分解為兩種中間體。經(jīng)研究確定1的有關(guān)物質(zhì)就是這兩種中間體的甲磺酸鹽。1目前尚未載入《中國(guó)藥典》2015年版，相關(guān)質(zhì)量控制的研究報(bào)告很少，只有少量關(guān)于殘留溶劑或痕量衍生雜質(zhì)的研究報(bào)告[8-11]，對(duì)藥物質(zhì)量控制最重要的關(guān)鍵有關(guān)物質(zhì)研究基本未見(jiàn)涉及，藥品中的有關(guān)物質(zhì)與藥品在臨床使用中產(chǎn)生的不良反應(yīng)有很大關(guān)系，因此建立一種可靠的有關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)方法十分必要。本研究建立了LC-MS/MS法同時(shí)定性、定量測(cè)定1中的兩種關(guān)鍵有關(guān)物質(zhì)含量，檢測(cè)迅速，避免了樣品不穩(wěn)定造成的影響，方法選擇性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確度高，能滿足藥品質(zhì)量控制的需要。

1 試藥與儀器

1.1 藥品與試劑

甲磺酸萘莫司他原料藥；對(duì)-胍基苯甲酸甲磺酸鹽對(duì)照品(4-guanidinobenzoic acidmethanesulfonate，2，圖1b)；6-脒基-2-萘酚甲磺酸鹽對(duì)照品（6-amidino-2-naphthol methanesulfonate，3，圖1c）；以上原料藥和對(duì)照品均為實(shí)驗(yàn)室自制，純度均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)的首家臨床產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn))。乙腈（色譜純）；甲酸（分析純）；去離子水由EPED實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水機(jī)制備。

1.2 設(shè)備

安捷倫1260-G6460型LC-MS/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)。

2 LC-MS/MS條件及檢測(cè)結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱

ZORBAX SB-C18(2.1*100mm,1.8um)，柱溫：30℃；流動(dòng)相：水-乙腈（30:70）,流速：0.2mL/min；進(jìn)樣量：2μL。

圖1a 甲磺酸萘莫司他結(jié)構(gòu)式

圖1b 對(duì)-胍基苯甲酸甲磺酸鹽結(jié)構(gòu)式

圖1c 6-脒基-2-萘酚甲磺酸鹽結(jié)構(gòu)式

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI源）；監(jiān)測(cè)模式：正離子監(jiān)測(cè)模式；毛細(xì)管電壓：4000V；霧化氣壓力：50psi；干燥氣流速：11L/min；干燥氣溫度：300℃；正離子全掃描范圍50-600。碎裂電壓：150V；碰撞能量25eV。

2.3 供試液制備

精密稱(chēng)定甲磺酸萘莫司他原料藥20mg，至10mL容量瓶中，以甲醇定容，精密量取該溶液0.1mL至10mL容量瓶中，以流動(dòng)相稀釋?zhuān)俅稳∷萌芤?mL至10mL容量瓶中以流動(dòng)相稀釋為供試品溶液。

2.4 采用LC-MS/MS聯(lián)用獲得1的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖

裂解途徑見(jiàn)圖2a。一級(jí)圖譜顯示主要碎片為m/z348、187、162（圖2b），m/z348為1脫去兩個(gè)甲烷磺酸后的6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯，m/z187、162為1酯鏈斷裂后的兩個(gè)中間體碎片，二級(jí)圖譜與兩個(gè)中間體對(duì)-胍基苯甲酸甲磺酸鹽（m/z180→163、m/z180→138）（圖3c）和6-脒基-2-萘酚甲磺酸鹽(m/z187→170、m/z187→143)（圖4c）對(duì)照品的質(zhì)譜圖一致，確證其結(jié)構(gòu)。

圖2a 甲磺酸萘莫司他裂解途徑

圖2b 甲磺酸萘莫司他的一級(jí)質(zhì)譜圖

3 有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

3.1 色譜條件

色譜柱ZORBAX SB-C18(2.1*100mm,1.8μm)；柱溫：30℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液-乙腈（30:70），流速：0.2mL/min；進(jìn)樣量：2μl。

3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI源）；監(jiān)測(cè)模式：正離子監(jiān)測(cè)模式；監(jiān)測(cè)離子對(duì)m/z180→163、m/z180→138（2），m/z187→170、m/z187→143（3）；毛細(xì)管電壓：4000V；霧化氣壓力：50psi；干燥氣流速：11L/min；干燥氣溫度：300℃；正離子全掃描范圍50-250；碎裂電壓：80和90V；碰撞能量18和20eV。

3.3 定性判定

用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法照3.1,3.2的儀器條件對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果做定性判定，如果檢出的色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品相一致，并且所選擇的監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)豐度比與標(biāo)準(zhǔn)樣品的離子對(duì)相對(duì)豐度比相一致，m/z180→163(100%)、m/z180→137.7（9.1%）（2）；m/z187→170（100%）,保留時(shí)間0.781min(圖3a,圖3b)；m/z187→142.8（29.1%）,保留時(shí)間0.896min（3）(圖4a,圖4b)，則可以判斷樣品中存在該有關(guān)物質(zhì)。

3.4 對(duì)照品溶液配制

分別精密稱(chēng)定2、3各20mg至10mL容量瓶中，以甲醇定容，配成濃度為2mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取該儲(chǔ)備液適量，以流動(dòng)相梯度稀釋?zhuān)渲瞥?的濃度為0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL和3的濃度為0.010μg/mL、0.025μg/mL、0.050μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL的系列濃度對(duì)照品溶液。

3.5 供試液制備

精密稱(chēng)定甲磺酸萘莫司他原料藥20mg，至10mL容量瓶中，以甲醇定容，精密量取該溶液0.1mL至10mL容量瓶中，以流動(dòng)相稀釋?zhuān)瑩u勻?yàn)楣┰嚻啡芤骸?/p>

圖3 對(duì)-胍基本甲酸甲磺酸鹽圖譜

圖4 6-脒基-2-萘酚甲磺酸鹽圖譜

3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在“3.1”和“3.2”項(xiàng)下液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析條件下，用對(duì)照品系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.4）分別進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。稀釋樣品在相同分析條件下檢測(cè)，以空白基線噪音的3倍峰高對(duì)應(yīng)的濃度為最低檢出濃度。線性方程分別為2：y=144.90x+6633.4，r=0.9999，最低檢出濃度0.01μg/mL；3：y=36.522x+131.59，r=0.9998，最低檢出濃度0.004μg/mL，表明在濃度范圍內(nèi)兩種有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的線性關(guān)系良好。

3.7 精密度試驗(yàn)

取待測(cè)樣品照3.5制備樣品測(cè)試溶液，按儀器測(cè)試條件重復(fù)測(cè)定6次，分別得到兩種有關(guān)物質(zhì)的含量結(jié)果，計(jì)算得兩種有關(guān)物質(zhì)含量的RSD分別為2.2%、3.1%，表明儀器精密度良好。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取待測(cè)樣品照3.5平行制備6份樣品溶液，按上述條件測(cè)定兩種有關(guān)物質(zhì)含量，計(jì)算得2、3的RSD分別為5.1%、3.2%，表明重復(fù)性良好。

3.9 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取待測(cè)樣品分別加入低、中、高三種濃度的兩種有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，照2.5制備樣品測(cè)試溶液，平行試驗(yàn)2份。兩種有關(guān)物質(zhì)低、中、高三種濃度的平均回收率分別為2：97.9%、99.9%、101.4%和3：99.6%、98.3%、99.8%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

3.10 有關(guān)物質(zhì)的含量測(cè)定

取三批樣品的測(cè)試液，每批平行兩份，按上述條件測(cè)定，計(jì)算含量。測(cè)得三批樣品中兩種有關(guān)物質(zhì)含量分別為：0.053%（2），0.31%（3）；0.11%，0.46%；0.092%，0.47%。

4 討論

甲磺酸萘莫司他的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易分解，有關(guān)物質(zhì)主要為兩個(gè)合成中間體的甲磺酸鹽。傳統(tǒng)的液相色譜法和薄層色譜法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度低，樣品在檢測(cè)過(guò)程中不可避免地有一定的分解，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。在與大量液相色譜法和薄層色譜法結(jié)果比較后，我們發(fā)現(xiàn)采用LC-MS/MS法測(cè)定甲磺酸萘莫司他有關(guān)物質(zhì)含量，分析時(shí)間短，靈敏度高，有比液相色譜法和薄層色譜法更低的檢出限，具有更高的準(zhǔn)確度。該方法同樣適用于甲磺酸萘莫司他的含量測(cè)定，我們以2.1的色譜條件和2.2的質(zhì)譜條件，監(jiān)測(cè)離子對(duì)m/z348.1→162、m/z348.1→187，內(nèi)標(biāo)法定量，同樣獲得了滿意的結(jié)果。有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品6-脒基-2-萘酚甲磺酸鹽為藥品制備中間體，可直接拿來(lái)使用，對(duì)-胍基苯甲酸甲磺酸鹽需專(zhuān)門(mén)制備，比較麻煩，考慮到質(zhì)譜本身的特點(diǎn)，我們嘗試直接用中間體對(duì)-胍基苯甲酸鹽酸鹽代替甲磺酸鹽做為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果也令人滿意。必須注意的是樣品的溶液穩(wěn)定性差，應(yīng)臨測(cè)現(xiàn)配。該方法高效、準(zhǔn)確，專(zhuān)屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，能滿足藥物生產(chǎn)質(zhì)量控制的需要。