栗永華，劉 偉，徐智凱，劉煒瑋，孫英杰，仇旭升，譚 磊，宋翠萍，廖 瑛，丁 鏟，孟春春

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

新城疫(Newcastle disease，ND)是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的嚴(yán)重疫病之一，新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)主要通過(guò)干擾素、TNF途徑和caspase途徑誘導(dǎo)受感染細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，從而產(chǎn)生病變效應(yīng)[1]。p53抑癌蛋白在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和抑制腫瘤惡性發(fā)展中起著重要作用，p53蛋白在DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡[2]、防止腫瘤細(xì)胞的增殖[3-4]以及腫瘤的形成[5-7]等方面發(fā)揮了重要的作用。

TP53誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR)的表達(dá)降低了細(xì)胞內(nèi)果糖-2，6-二磷酸酶(fructose-2，6-bisphosphatase，F(xiàn)-2，6-P2)的水平，磷酸果糖激酶降低，果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate，F(xiàn)-6-P)水平升高，從而抑制了糖酵解，使6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate，G-6-P)進(jìn)入磷酸戊糖(pentose phosphate pathway，PPP)途徑增加[8-9]，降低了細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的含量[10]，從而減少細(xì)胞凋亡和DNA損傷，導(dǎo)致內(nèi)源性TIGAR表達(dá)對(duì)p53誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡產(chǎn)生抑制作用[11]。

有研究表明，TIGAR在皮層神經(jīng)元預(yù)處理后，增加PPP途徑，促進(jìn)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的產(chǎn)生，清除ROS，抑制細(xì)胞凋亡從而維持細(xì)胞存活[12]。一些研究表明，p53基因通過(guò)平衡TIGAR和DRAM具有調(diào)節(jié)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡和自噬[13-14]。本研究旨在構(gòu)建有利于NDV增殖的疫苗候選細(xì)胞株，所以選用的細(xì)胞是易于NDV增殖的BHK-21細(xì)胞，在前人研究的基礎(chǔ)上，擴(kuò)增出雞TIGAR基因并首次擴(kuò)增出倉(cāng)鼠的TIGAR基因，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TIGAR基因的BHK-21細(xì)胞系。并評(píng)價(jià)NDV中強(qiáng)弱毒株在不同細(xì)胞系中的增殖滴度，意在比較不同來(lái)源的TIGAR基因發(fā)揮抗凋亡功能差異。為是否可以借助TIGAR基因構(gòu)建的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系，使NDV在疫苗生產(chǎn)中突破不能體外大量擴(kuò)增的瓶頸作出新的嘗試。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、病毒、細(xì)胞

NDV強(qiáng)毒株ZJ1購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；雞源3×Flag-TIGAR質(zhì)粒[20]、Phage質(zhì)粒、PMD 2G質(zhì)粒、PAX質(zhì)粒、Polyboren、NDV中強(qiáng)毒SH15、NDV弱毒株LaSota、NDV強(qiáng)毒株Herts/33、293T細(xì)胞系和BHK-21細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存，DH5α感受態(tài)細(xì)胞為天根公司產(chǎn)品。

1.2 抗體與試劑

Flag抗體(貨號(hào)8146S)、β-actin抗體(貨號(hào)3700S)、PARP抗體(貨號(hào)9532S)和Caspase 3兔抗體(貨號(hào)29629)均購(gòu)于Cell Signaling Technology公司；NotⅠ限制性內(nèi)切酶(貨號(hào)FD0593)、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶(貨號(hào)FD0684)、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；Blasticidin S HCL(貨號(hào)S7419)購(gòu)于Selleck公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(貨號(hào)DP117)購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；SYBR Green qPCR mix(貨號(hào)2092)購(gòu)于廣州東盛生物科技有限公司；Trizol、Alexa FlourTM 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit為T(mén)hermo Fisher公司產(chǎn)品，TaqDNA聚合酶、dNTP、T4 DNA連接酶為諾唯贊公司產(chǎn)品，M-MLV、RNasin、FuGen轉(zhuǎn)染試劑為Promega公司產(chǎn)品，ECL發(fā)光液為圣爾公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 設(shè)計(jì)倉(cāng)鼠TIGAR基因和雞TIGAR基因的相關(guān)引物 根據(jù)雞TIGAR基因的序列(登錄號(hào)MH511993.1)以及GenBank預(yù)測(cè)的倉(cāng)鼠TIGAR基因的序列(登錄號(hào)：XM_005084096.3)設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.3.2 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 將BHK-21細(xì)胞按照106的細(xì)胞密度接種于6孔板中，待長(zhǎng)滿后，用800 μL Trizol裂解細(xì)胞提取RNA，加入Oligo 18T逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再分別以提取的倉(cāng)鼠cDNA和前期構(gòu)建的雞源3×Flag-TIGAR質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后酶切連入Phage包裝質(zhì)粒載體。

1.3.3 構(gòu)建、鑒定及篩選穩(wěn)定表達(dá)倉(cāng)鼠源和雞源TIGAR基因的細(xì)胞系 將293T細(xì)胞按照2×105的細(xì)胞密度傳至100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。每皿轉(zhuǎn)染PAX(6 μg)、PMD 2G(3 μg)和Phage-TIGAR(9 μg)。轉(zhuǎn)染60 h后，將包裝好的慢病毒上清收集凍存?zhèn)溆?。隨后取適量包裝好的慢病毒接種于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞中，并加入2 μL polyboren提高感染效率。繼續(xù)培養(yǎng)8 h后更換維持液，并在維持液中加入終濃度為0.4 mg·mL-1的Blasticidin進(jìn)行加壓篩選。對(duì)存活細(xì)胞用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆篩選，將單克隆生長(zhǎng)的細(xì)胞分別在核酸水平和蛋白水平對(duì)TIGAR基因進(jìn)行鑒定。并將陽(yáng)性細(xì)胞連續(xù)傳代30次，每隔10代使用qPCR引物鑒定TIGAR基因的表達(dá)量以及傳代穩(wěn)定性。采用20 μL qPCR體系：qPCR Mix 10.0 μL，Primer-F、Primer-R各0.4 μL，DNA 2.0 μL，ddH2O 7.2 μL；qPCR程序：94 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3.4 流式檢測(cè)重組細(xì)胞系的自然凋亡率及抗凋亡能力 將BHK-21、BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞按照1×105的數(shù)量接種于6孔板，每24 h收集細(xì)胞樣品于離心管中，直到192 h。將細(xì)胞樣品于4 ℃ 1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗3次，加入500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，分別再加入5 μL PI和25 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min，隨后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。隨后將上述3種細(xì)胞按照1×106的數(shù)量接種于6孔板中，分別在培養(yǎng)24和48 h時(shí)，使用凋亡誘導(dǎo)劑Staurosporine預(yù)先處理2 h后，再使用流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 Western blot檢測(cè)重組細(xì)胞系的凋亡通路變化情況 將BHK-21、BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞系按照1×106的數(shù)量接種至6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，將Herts/33病毒按照0.1 MOI感染細(xì)胞。在接毒后的30和36 h收集蛋白樣品，使用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的變化情況，并使用image J軟件掃描蛋白灰度。

1.3.6 病毒生長(zhǎng)滴度測(cè)定 將ZJ1、SH15和LaSota 病毒株按照0.01 MOI的病毒量感染BHK-21、BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞，在感染后每隔24 h收集細(xì)胞上清至96 h，將細(xì)胞上清作為病毒原液檢測(cè)細(xì)胞上清中病毒的TCID50。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot鑒定亞克隆細(xì)胞

將測(cè)序鑒定為陽(yáng)性的BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞經(jīng)過(guò)亞克隆后擴(kuò)大保存，并用Western blot(Flag抗體)鑒定外源TIGAR基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞系均獲得高表達(dá)細(xì)胞株(圖1)，表明兩種細(xì)胞系構(gòu)建成功。

A.BHK-21細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)倉(cāng)鼠TIGAR基因；B.BHK-21細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)雞TIGAR基因

2.2 qPCR鑒定重組細(xì)胞的穩(wěn)定性

qPCR鑒定結(jié)果表明，所得到的BHK-21-chTIGAR細(xì)胞中雞源TIGAR基因和BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞中倉(cāng)鼠源TIGAR基因的開(kāi)放閱讀框序列cDNA已經(jīng)穩(wěn)定的整合到細(xì)胞基因組中，能夠隨著B(niǎo)HK-21細(xì)胞系傳代而穩(wěn)定持續(xù)地轉(zhuǎn)錄和表達(dá)且序列無(wú)突變(圖2)。

圖2 qPCR檢測(cè)BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞穩(wěn)定性

2.3 重組細(xì)胞系的自然凋亡率

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖3)表明，BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞在培養(yǎng)48和72 h后，細(xì)胞的自然凋亡率高于BHK-21細(xì)胞，且差異顯著(P<0.01)，在96和144 h其凋亡率顯著低于BHK-21細(xì)胞(P<0.05)，而在120 h無(wú)明顯差異。BHK-21-chTIGAR細(xì)胞的凋亡率在48、72、120和144 h時(shí)均明顯高于野生型BHK-21細(xì)胞，且差異極顯著(P<0.01)。

ns.P>0.05；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001

存活試驗(yàn)表明BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞在生長(zhǎng)到96 h時(shí)細(xì)胞存活率明顯高于BHK-21細(xì)胞，且差異顯著(P<0.05)，在144 h明顯高于BHK-21細(xì)胞，且差異極顯著(P<0.001)。而B(niǎo)HK-21-chTIGAR細(xì)胞的存活率在72和120 h明顯低于BHK-21細(xì)胞，且差異極顯著(P<0.001)，在96和144 h低于BHK-21細(xì)胞，且差異顯著(P<0.05)。倉(cāng)鼠源TIGAR重組細(xì)胞系在生長(zhǎng)后期發(fā)揮了很好的抗凋亡作用，而雞源TIGAR細(xì)胞系存活率反而低于野生型BHK-21細(xì)胞。

2.4 重組細(xì)胞系的抗凋亡能力

使用Staurosporine對(duì)BHK-21、BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞提前2 h誘導(dǎo)凋亡，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)3種細(xì)胞的抗凋亡能力。結(jié)果見(jiàn)圖4A、B，在BHK-21細(xì)胞24 h誘導(dǎo)凋亡后，其早期凋亡率(2.3%)高于BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞(1.1%)，且差異顯著(P<0.01)；但與BHK-21-chTIGAR細(xì)胞的早期凋亡率(2.6%)無(wú)顯著差異，晚期凋亡率三者均差異不顯著。在培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，BHK-21細(xì)胞的早期凋亡率(13.1%)明顯高于BHK-21-chTIGAR細(xì)胞的早期凋亡率(5.4%)和BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞的早期凋亡率(4.9%)，且差異均極顯著(P<0.01或P<0.001)；但晚期凋亡率三者差異亦均無(wú)差異。流式檢測(cè)結(jié)果表明BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞的抗凋亡能力明顯高于BHK-21和BHK-21-chTIGAR細(xì)胞。

A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；B.統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞凋亡率；ns.P>0.05；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001

2.5 重組細(xì)胞系凋亡通路變化的Western blot檢測(cè)

使用相同劑量Herts/33病毒感染BHK-21、BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞，并利用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵凋亡蛋白的變化情況。結(jié)果如圖5所示，在病毒感染后30和36 h時(shí)，BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞中PARP、caspase-3的裂解蛋白表達(dá)量均低于BHK-21和BHK-21-chTIGAR細(xì)胞。BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞在感染后30 h時(shí)，caspase-3表達(dá)量顯著(P<0.05)下降，PARP的表達(dá)量極顯著下降(P<0.001)。在感染后36 h時(shí)，PARP和caspase-3表達(dá)量均極顯著下降(P<0.01)。兩種凋亡指征蛋白在BHK-21-chTIGAR細(xì)胞中的表達(dá)量與野生型BHK-21細(xì)胞相比無(wú)明顯變化(Western blot圖片結(jié)果)，灰度掃描后的數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果在凋亡發(fā)生通路方面進(jìn)一步證實(shí)了BHK-21-hamTIGAR具備較高水平的抗凋亡能力。

A.Western blot檢測(cè)BHK-21、BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞中PARP、caspase-3的表達(dá)量；B.30 h PARP/β-actin的相對(duì)表達(dá)量；C.36 h PARP/β-actin的相對(duì)表達(dá)量；D.30 h caspase-3/β-actin的相對(duì)表達(dá)量；E.36 h caspase-3/β-actin的相對(duì)表達(dá)量；ns.P>0.05；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001

2.6 病毒生長(zhǎng)滴度測(cè)定

為比較NDV在穩(wěn)定表達(dá)TIGAR基因的重組細(xì)胞系和野生型BHK-21上的增殖水平，分別選取NDV的強(qiáng)、中、弱毒株進(jìn)行比較。結(jié)果如圖6所示，感染新城疫強(qiáng)毒ZJ1 72 h時(shí)，BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞內(nèi)病毒滴度(5.67)高于BHK-21細(xì)胞(5.27)，且差異顯著(P<0.05)。感染新城疫中強(qiáng)毒SH15 48和96 h時(shí)，BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞內(nèi)病毒滴度(5.37和4.90)分別高于BHK-21細(xì)胞(5.13和4.67)，且差異顯著(P<0.05)。感染新城疫弱毒LaSota 72和96 h時(shí)，BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞內(nèi)病毒滴度(4.63和4.07)高于BHK-21細(xì)胞(4.63和3.77)，且差異顯著(P<0.05)。但在BHK-21-chTIGAR細(xì)胞上3種病毒不同時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度均與BHK-21野生型細(xì)胞無(wú)差異。

A.新城疫強(qiáng)毒ZJ1；B.新城疫中強(qiáng)毒SH15；C.新城疫弱毒LaSota; ns.P>0.05; *.P<0.05

3 討 論

TIGAR蛋白是可以調(diào)節(jié)糖酵解和凋亡作用的蛋白，TIGAR蛋白通過(guò)抑制糖酵解途徑，增加磷酸戊糖途徑，可產(chǎn)生大量的5-磷酸核糖，是DNA修復(fù)和合成的重要原料[15]；還可以通過(guò)維持還原型谷胱甘肽所需的NADPH水平來(lái)調(diào)節(jié)ROS水平，保護(hù)細(xì)胞免受ROS的損傷并保持線粒體的完整性，細(xì)胞內(nèi)NADPH升高，ROS和自噬活性降低[16]，因此TIGAR具有抑制細(xì)胞凋亡和自噬的作用[17-19]。

本研究首次擴(kuò)增出倉(cāng)鼠的TIGAR全長(zhǎng)基因序列，構(gòu)建慢病毒包裝重組質(zhì)粒phage-hamTIGAR，利用包裝慢病毒的方法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TIGAR基因的BHK-21細(xì)胞系，通過(guò)Western blot和DNA測(cè)序篩選出表達(dá)TIGAR基因的BHK-21細(xì)胞系并將其純化；qPCR檢測(cè)結(jié)果表明所構(gòu)建細(xì)胞系可長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)TIGAR基因。通過(guò)Western blot、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞、BHK-21-chTIGAR細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞的抗凋亡能力，其結(jié)果顯示，BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞的抗凋亡能力高于BHK-21-chTIGAR細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞，可能由于倉(cāng)鼠TIGAR基因?qū)τ贐HK-21細(xì)胞是內(nèi)源基因，雞TIGAR基因?qū)τ贐HK-21細(xì)胞是外源基因所導(dǎo)致。測(cè)定不同毒力的新城疫病毒在BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞、BHK-21-chTIGAR細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明新城疫的強(qiáng)中弱毒株在BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞上的病毒滴度均高于BHK-21-chTIGAR細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞，表明該細(xì)胞系可作為NDV高效增殖疫苗株的潛在選擇。

有研究將雞源TIGAR基因過(guò)表達(dá)至DF-1細(xì)胞系后，細(xì)胞的抗凋亡能力明顯增加[20]，本研究將雞源TIGAR基因穩(wěn)定表達(dá)至BHK-21細(xì)胞系中，并沒(méi)有明顯的抗凋亡作用，可能是由于TIGAR基因?qū)τ贒F-1細(xì)胞是內(nèi)源性基因，而對(duì)于BHK-21細(xì)胞是異源性基因，所以其抗凋亡效果并不明顯，結(jié)果中倉(cāng)鼠源TIGAR對(duì)于BHK-21細(xì)胞來(lái)說(shuō)屬于內(nèi)源性基因，所以其抗凋亡作用明顯，根據(jù)這兩個(gè)試驗(yàn)可以初步猜測(cè)將內(nèi)源性基因過(guò)表達(dá)后，可能發(fā)揮的作用更加明顯。付托[21]將人源TIGAR基因穩(wěn)定表達(dá)至CHO細(xì)胞系中，通過(guò)提高NADPH從而維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，降低ROS的水平，抑制線粒體途徑引起的細(xì)胞凋亡，從而使CHO細(xì)胞抗凋亡能力提升。Ye等[22]用RNA干擾沉默HepG 2細(xì)胞中的TIGARmRNA后，主要通過(guò)細(xì)胞凋亡和自噬作用抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí)，TIGAR過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NADPH升高，并降低ROS水平，抑制細(xì)胞自噬，隨后通過(guò)抑制ROS水平介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23-27]。用D-半乳糖處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤可以誘導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡和自噬[28]。這些結(jié)果都與本文的結(jié)論相一致，表明通過(guò)控制TIGAR基因的表達(dá)可對(duì)細(xì)胞的凋亡水平進(jìn)行精確調(diào)控。

4 結(jié) 論

利用慢病毒包裝法成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)TIGAR基因的BHK-21細(xì)胞系。構(gòu)建的BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞相比于BHK-21細(xì)胞和BHK-21-chTIGAR細(xì)胞其抗凋亡功能明顯提高，且病毒滴度也明顯增加，有助于新城疫病毒的復(fù)制，構(gòu)建的BHK-21-hamTIGAR細(xì)胞可用作新城疫的候選疫苗細(xì)胞株。