李 寧，郭慧芳，王白玉，喬麒龍，黃 慶，李永濤，王 增，趙 軍

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450046)

塞內(nèi)卡病毒A(Senecavirus A, SVA)是小RNA病毒科(Picornaviridae)塞內(nèi)卡病毒屬(Senecavirus)唯一成員，為無(wú)囊膜單股正鏈線性RNA病毒[1-3]。SVA基因組大小約為7.3 kb，由5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)、1個(gè)編碼多聚蛋白的開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)和3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)組成[4-6]。SVA早期被稱作塞內(nèi)卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)，原型為SVV-001[1,7]。塞內(nèi)卡病毒病(Senecavirus disease，SVD)最先于2007年在加拿大被報(bào)道，其特征是鼻吻和蹄冠部產(chǎn)生明顯水皰，發(fā)病母豬伴隨發(fā)熱和厭食，新生仔豬表現(xiàn)為腹瀉、脫水、神經(jīng)癥狀和急性死亡，尤其是1～4日齡的新生仔豬發(fā)病率可達(dá)70%，病死率為15%～30%[3]。隨后在美國(guó)、加拿大、哥倫比亞、巴西、泰國(guó)、越南等國(guó)家的豬群中均報(bào)道有SVA的廣泛分布[8-16]。

在中國(guó)，SVD于2015年在廣東首次被報(bào)道，隨后在廣西、福建、湖北、河南、山東和黑龍江等省(區(qū))陸續(xù)發(fā)生SVD疫情[17-34]。SVA引起的臨床癥狀與口蹄疫、豬水皰病、水皰性口炎等疫病的臨床癥狀相似，臨床上難以區(qū)分。SVA在我國(guó)的廣泛流行嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。當(dāng)前，我國(guó)尚沒(méi)有商品化疫苗控制SVA的感染，加強(qiáng)SVA流行毒株的分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)對(duì)于篩選未來(lái)用于制備疫苗的候選毒株，研發(fā)行之有效的疫苗和檢測(cè)試劑至關(guān)重要。

2019年11月，筆者從河南省新鄉(xiāng)市長(zhǎng)垣縣某育肥豬場(chǎng)送檢的臨床樣品中分離到1株SVA，本研究對(duì)其進(jìn)行了全基因序列測(cè)定和分析，以期為全面了解SVA在我國(guó)的流行狀況和制定合理的防控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒

SVA CH-HNCY-2019株由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病教研室自河南新鄉(xiāng)長(zhǎng)垣縣某發(fā)生典型的水皰病的育肥豬豬場(chǎng)分離并保存，病毒滴度為10-7TCID50· 0.1 mL-1。

1.2 引物設(shè)計(jì)和SVA基因擴(kuò)增

參照SVA原型毒株SVV-001株全基因序列(GenBank登錄號(hào)：NC011349)，設(shè)計(jì)用于分段擴(kuò)增SVA基因組序列的引物(表1)。提取SVA CH-HNCY-2019 病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增SVA CH-HNCY-2019基因組片段。

表1 SVA全基因序列分段擴(kuò)增引物

1.3 SVA CH-HNCY-2019全基因序列測(cè)定與比較分析

將擴(kuò)增的SVA基因各片段純化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將所得序列利用DNA Star Lasergene v7.0軟件包拼接，獲得完整病毒基因組序列并上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，并與GenBank上已發(fā)表的中國(guó)SVA流行毒株和國(guó)外SVA代表株序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析；應(yīng)用MEGA6軟件中的Neighbor-joining統(tǒng)計(jì)方法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴(kuò)增

利用設(shè)計(jì)的SVA特異性引物將CH-HNCY-2019基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增，擴(kuò)增出8個(gè)片段，與預(yù)期的目的片段大小相符(圖1)。

M.DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); F1～F8.8個(gè)覆蓋SVA基因組的重疊片段(1 018、951、1 020、1 142、1 118, 1 248、1 100和705 bp)

2.2 SVA CH-HNCY-2019株全基因序列測(cè)定和比較分析

CH-HNCY-2019基因組全長(zhǎng)為7 294 bp，包括671 bp的5′UTR，1個(gè)編碼2 182個(gè)氨基酸的前體多聚蛋白開(kāi)放閱讀框以及76 bp具有Poly(A)特性的3′UTR。將CH-HNCY-2019 全基因組序列上傳到GenBank，獲得登錄號(hào)為MT713137。

將CH-HNCY-2019全基因組與GenBank中公布的國(guó)內(nèi)外不同年代的SVA代表株的全基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析顯示(圖2)，包括CH-HNCY-2019在內(nèi)的所有中國(guó)毒株與美國(guó)2015年及其以后的毒株，以及哥倫比亞、巴西、越南的毒株都屬于一個(gè)大群，提示這些毒株具有相同的遺傳來(lái)源。所有中國(guó)毒株又分屬4個(gè)獨(dú)立的分支，其中，CH-HNCY-2019和另一個(gè)廣東2019年分離株CH-GDZS-2019位于大多數(shù)2017—2018年中國(guó)毒株所在的中國(guó)Ⅰ這一獨(dú)立分支中，CH-HNCY-2019與GD03/2017、CHhb17、GD01/2017、SVA/CHN/01/2017和SVV-SC-0102018屬于中國(guó)Ⅰ獨(dú)立分支的同一小分支。另外3個(gè)廣東2019年分離株CH-GDHZ01-2019、CH-GDHZ02-2019、CH-GDMZ-2019則與部分2017—2018年中國(guó)毒株屬于另一個(gè)中國(guó)Ⅱ獨(dú)立分支，中國(guó)Ⅱ分支毒株與美國(guó)2015年及其以后的毒株進(jìn)化關(guān)系較近。由分離自廣東、福建和遼寧的部分2017—2018年的毒株組成的中國(guó)Ⅲ分支與哥倫比亞的毒株進(jìn)化關(guān)系較近；由2015—2016年分離株組成的中國(guó)Ⅳ分支與最近報(bào)道的越南分離株和2015年的巴西分離株親緣關(guān)系較近。

全基因組序列同源性分析顯示，SVA CH-HNCY-2019毒株與其他SVA毒株的核苷酸相似性為93.2%～99.0%，與SVA原型毒株SVV-001的相似性為93.2%，與其他美國(guó)毒株的相似性為93.3%～98.1%，與加拿大毒株的相似性為95.9%～96.3%，與泰國(guó)毒株的相似性為94.4%～94.8%，與越南毒株的相似性為96.4%，與巴西毒株的相似性為97%，與哥倫比亞毒株的相似性為97.8%，與中國(guó)分離株的相似性為95.9%～99.0%。

將包括CH-HNCY-2019在內(nèi)的2019年中國(guó)SVA分離株的結(jié)構(gòu)基因氨基酸序列與中國(guó)其他年代的分離株以及美國(guó)經(jīng)典毒株SVV-001和強(qiáng)毒代表株SD15-26進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，CH-HNCY-2019的VP1蛋白的722位氨基酸由L突變成了Q，而其他2019年中國(guó)SVA分離株CH-GDZS-2019、CH-GDMZ-2019、CH-GDHZ01-2019和CH-GDHZ02-2019，中國(guó)其他年代的分離株，以及SVV-001和SD15-26毒株的722位氨基酸均為L(zhǎng)；VP3蛋白的499位氨基酸由A突變?yōu)閂，528位氨基酸由P突變位S，582位氨基酸由E突變位K；3A蛋白的1 430位 氨基酸由A突變位V。所有2019年中國(guó)分離株的3C蛋白1 685位氨基酸均為M，而其他國(guó)內(nèi)外SVA毒株3C蛋白1 685位氨基酸均為L(zhǎng)。此外，與SVV-001相比，所有中國(guó)毒株和SD15-26毒株的VP1均存在多處相同的氨基酸替換(Q735A、E736T、A766V、G770D、F834Y和I912V)；VP2蛋白也存在3處相同的氨基酸替換(T165I、N368S和A428T)；VP3蛋白存在多處氨基酸替換(L452I、E491G、V497E、T502A和V603I)。

3 討 論

SVA在我國(guó)的廣泛流行嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，本研究獲得SVA分離株CH-HNCY-2019毒株與其他SVA毒株的核苷酸相似性為93.2%～99.0%，與中國(guó)分離株的相似性為95.9%～99%，而與SVA原型毒株SVV-001的相似性最低，只有93.2%。中國(guó)自2015年以來(lái)的所有毒株在全基因組進(jìn)化樹(shù)上分屬同一大群的4個(gè)不同分支，包括CH-HNCY-2019在內(nèi)的5株2019年中國(guó)SVA分離株分屬兩個(gè)不同的分支。這一結(jié)果提示，我國(guó)SVA的流行株具有相同的起源，但存在多樣性，且在不斷演變。研究這些處于進(jìn)化樹(shù)上不同分支的SVA中國(guó)流行株在免疫學(xué)上的交叉反應(yīng)性對(duì)于研發(fā)防控SVA感染的疫苗具有重要意義。

對(duì)中國(guó)的SVA分離株的結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析結(jié)果顯示，CH-HNCY-2019的VP1、VP3蛋白均存在多位點(diǎn)突變。這些位點(diǎn)氨基酸的突變對(duì)于病毒的毒力、免疫原性和在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的滴度、蝕斑大小等特性的影響值得進(jìn)一步深入研究。本團(tuán)隊(duì)目前正在通過(guò)反向遺傳技術(shù)進(jìn)行這方面的研究。

4 結(jié) 論

成功獲得1株SVA CH-HNCY-2019全基因組序列，研究結(jié)果提示，SVA中國(guó)流行株具有多樣性，而且在不斷地演變，應(yīng)加強(qiáng)SVA的分子流行病學(xué)調(diào)查、生物安全措施和疫苗研發(fā)以防止SVA在我國(guó)豬群中的廣泛傳播。