胡文雄 蔣家正 李華

海南西部中心醫(yī)院，海南 儋州 571799

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一種進行性全身性骨骼疾病，其特征是骨量降低和骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在絕經(jīng)后婦女中非常常見[1]。由于雌激素水平和卵巢功能降低，導(dǎo)致成骨細(xì)胞形成和破骨細(xì)胞吸收之間失衡，引發(fā)骨脆性增加和易于骨折[2]。因此，開發(fā)有效和安全的PMOP治療藥物已成為當(dāng)務(wù)之急。雷奈酸鍶(strontium ranelate，SR)在歐洲國家被廣泛用于治療絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥。眾所周知，SR通過增加骨形成和減少骨吸收[3-4]，可以降低椎體和髖部骨折的風(fēng)險，從而對骨產(chǎn)生合成代謝作用[5-6]。辛伐他汀(simvastatin，SIM)具有降血脂作用，用于治療心血管疾病。近年來，藥學(xué)領(lǐng)域一直致力于研究和發(fā)現(xiàn)SIM的新作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SIM具有促進成骨和抑制破骨作用，且可以顯著提高骨組織中BMP-2的表達(dá)，這些結(jié)果提示SIM可能用于治療骨質(zhì)疏松癥[7-8]。鑒于SIM以及SR促進成骨和抑制破骨的效果，本研究通過使用SIM以及SR干預(yù)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性的影響，以探索兩者聯(lián)合使用治療骨質(zhì)疏松癥的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

30只12周齡雌性SD大鼠由上海實驗中心提供；辛伐他汀、雷奈酸鍶和α-MEM培養(yǎng)基購自GIBCO BRL(Grand Island，NY，USA)；用于基礎(chǔ)培養(yǎng)的α-MEM購自HyClone；胎牛血清(FBS)購自GIBCO(目錄號：16400-044)；核因子-B配體的人重組受體活化劑(RANKL，cat：400-30，批號：0209437)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF，cat：400-28，批號0310418)購自PeproTech；二抗購自中國北京夏思生物技術(shù)有限公司(Pro-spec，cat：SV30010)；針對GSK3β(Ab-9;cat：A7098)、GSK3(cat：B7098)、AKT(Ab-124;cat：B0407)、AKT(磷酸化Ser473;cat：A7005)、基質(zhì)金屬蛋白酶14(cat：CO266)的抗體β-catenin(Ab-33/37;cat：B7022-1)和β-連環(huán)蛋白(phospho-Ser33 cat：A7022)購自Assay Biotech；二抗(目錄號：Abmart M21001 L，目錄號：HA1001)購自Assay Biotech；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所(A059-2)。

1.2 方法

1.2.1成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的培養(yǎng):原代成骨細(xì)胞來源于出生24 h的乳鼠顱骨，用PBS洗滌。解剖出顱骨后，用含有青霉素/鏈霉素(PS)的冷PBS溶液洗骨骼2～3次。使用牙鉆取出長度、寬度和厚度均為1 mm的骨碎片；將骨樣品放置在充滿0.1 %胰蛋白酶的離心管中，放置在搖水浴(120 次/min)中20 min。然后，將顱骨放入50 mL離心管中，用0.2 %的膠原酶在37 ℃搖動水浴(120圈/min)中孵育兩次共60 min。通過添加生長介質(zhì)和反復(fù)移液終止反應(yīng)，并使用濾網(wǎng)去除骨碎片。收集濾液，在1 200g離心，4 ℃下離心8 min，然后丟棄上清液。細(xì)胞在含10 %胎牛血清和1 % PS(2 mL/孔)的α-MEM中復(fù)蘇，在37 ℃下用5 % CO2孵育2 d，每3天更換一次培養(yǎng)基[9]。獲取5周齡雄性SD大鼠的股骨和脛骨，中間截斷股骨和脛骨髓腔使用培養(yǎng)液洗滌。使用大鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)物誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞。將細(xì)胞放置于含10 %FBS和1 %PS的α-MEM中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)環(huán)境為5 %CO2和37 ℃。然后將非粘附細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有M-CSF(25 ng/mL)+ RANKL(50 ng/mL)的α-MEM中培養(yǎng)以觀察破骨細(xì)胞的形成[10]。

1.2.2茜素紅染色:為了檢查成骨細(xì)胞的基質(zhì)礦化，將細(xì)胞放置于含有50 μg/ mL維生素C和10 mmol/L β-甘油磷酸鹽的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。隨后一列孔加入 5 mmol /L的 SR (SR組)，一列 孔 加 入5 mmol /L的 SIM(SIM組)，一列孔同時加入2.5 mmol /L的SIM和SR(SIM +SR組)，一列孔不加入任何藥物為對照組。將成骨細(xì)胞培養(yǎng)21 d后，除去上清液，用PBS沖洗細(xì)胞3次；其中使用的SIM和SR劑量對成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)毒副作用。然后將細(xì)胞用95 %乙醇原位固定10 min，用蒸餾水沖洗兩次，用茜素紅染色30 min，用蒸餾水沖洗兩次，以觀察紅色礦化結(jié)節(jié)。使用分光光度計在562 nm的波長下測量所得上清液的光密度。收集對數(shù)期大鼠成骨細(xì)胞，培養(yǎng)72 h，然后用PBS洗滌3次。在液氮中反復(fù)冷凍并解凍后重新收集細(xì)胞。使用ALP測試試劑盒(A059-2)測量ALP活性。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。使用分光光度計測定各組管的吸光度。

1.2.3ALP活性和骨坑實驗:在96孔羥基磷灰石(HA)涂層板(康寧，紐約州，美國)的每孔中加入250 μL等位基因α-MEM，并在37 ℃、5 % CO2中孵育2 d；隨后，將非誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體添加到固定細(xì)胞中，并在37 ℃、5 % CO2中孵育2 d (以下在添加10 %FBS、1 % 25 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL mycillin的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中)，隨后一列孔加入 5 mmol /L的 SR (SR組)，一列 孔 加 入5 mmol /L的 SIM(SIM 組)，一列孔同時加入2.5 mmol /L的SIM和SR(SIM +SR組)，一列孔不加入任何藥物為對照組，培養(yǎng)14 d。使用Media Cybernetics軟件分析圖像(Silver Spring，MD，USA)[11]。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡分析:根據(jù)Bicinchoninic Acid(BCA)試劑盒(Boster，中國武漢)提供的說明書，將細(xì)胞樣品離心后提取的上層蛋白在裝載緩沖液(30 μg/孔)中于95 ℃煮沸，持續(xù)10 min。使用12 %凝膠通過電泳分離蛋白質(zhì)樣品，然后使用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Millipore，Bedford，MA，USA)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。在室溫下用5 %脫脂奶粉孵育2 h后，將一抗溶液加入膜中并在4 ℃保持過夜;然后將膜用TBS-T緩沖液洗滌5次，每次10 min，并在室溫下與對應(yīng)二抗溫育1 h。使用增強的化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)來捕獲圖像用于分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并使用SPSS19.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)通過單因素方差A(yù)NOVA分析。P<0.05、P<0.01或P<0.001表示比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信號通路改變

圖1顯示了單獨使用SIM或SR或用SIM聯(lián)合SR處理后成骨細(xì)胞中AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信號通路的變化。單獨給予SIM或SR后，成骨細(xì)胞中p-Akt/Akt和β-Gsk3β/Gsk3升高，p-β-catenin/β-catenin和NFATC1/β-catenin降低，在使用SIM聯(lián)合SR處理后，相同的比率趨勢變得更加明顯。相比之下，SIM或SR或SIM聯(lián)合SR處理對破骨細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量的比率有相反的影響(圖2)。這些結(jié)果表明，SIM聯(lián)合SR對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中AKT/GSK3NFATC1/β/β-catenin/NFATC1信號傳導(dǎo)的作用，比單獨使用兩種藥物中的任何一種都要強。

圖1 成骨細(xì)胞中AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信號傳導(dǎo)的Western blot結(jié)果注：a：WB檢測結(jié)果；b～e：蛋白表達(dá)定量結(jié)果。Fig.1 Western blot results of AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1 signaling in osteoblasts

圖2 破骨細(xì)胞中AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信號傳導(dǎo)的Western blot結(jié)果注：a：WB檢測結(jié)果；b～e：蛋白表達(dá)定量結(jié)果。Fig.2 Western blot results of AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1 signaling in osteoclasts

2.2 成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的改變

進一步探索了在體外研究SIM聯(lián)合SR是否會影響破骨細(xì)胞的骨形成和吸收能力。此外，評估SIM、SR或SIM聯(lián)合SR對兩種細(xì)胞類型的成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成、破骨細(xì)胞骨吸收和功能標(biāo)志物水平的影響。使用SIM、SR或SIM聯(lián)合SR處理的成骨細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)形成和ALP活性如圖3所示。SIM或SR均能促進成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成和ALP活性。然而，SIM聯(lián)合SR顯著增加了形成的礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量和成骨細(xì)胞的ALP活性。

圖3 茜素紅染色的礦化結(jié)節(jié)和成骨細(xì)胞ALP活性注：a：茜素紅染色的礦化結(jié)節(jié)；b:礦化相對活性；c：細(xì)胞ALP活性。Fig.3 Mineralized nodules as visualized by Alizarin red staining and ALP activity in osteoblasts

圖4顯示SIM、SR或SIM聯(lián)合SR處理對破骨細(xì)胞骨吸收能力和TRACP活性。單獨使用SIM和SR均可降低破骨細(xì)胞的骨吸收面積并抑制TRACP的活性；然而，在SIM聯(lián)合SR聯(lián)合應(yīng)用后，骨吸收面積顯著降低，并且破骨細(xì)胞的TRACP活性明顯低于單獨使用SIM和SR的結(jié)果。這些體外實驗結(jié)果表明，與單獨使用SIM或SR相比，SIM和SR聯(lián)合應(yīng)用能更好地促進骨形成，抑制骨吸收。

圖4 破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和TRACP活性的改變注：a：骨坑實驗結(jié)果；b:骨坑定量結(jié)果；c：細(xì)胞TRACP活性。Fig.4 Osteoclast-mediated changes in bone resorption and TRACP activity

3 討論

本研究表明SIM和SR均能抑制AKT-GSK3-β-β-catenin-NFATC1信號通路激活，SIM聯(lián)合SR效果更加。雖然SIM在常規(guī)劑量下副作用較小，但是藥物療效有劑量依耐性，特別是在長期應(yīng)用中，這嚴(yán)重限制了它的臨床價值[12]，本研究中選取較低劑量的SIM，通常情況下對細(xì)胞無毒副作用[12]。SR治療骨質(zhì)疏松癥雖然治療有劑量依耐性，但是較低劑量的副作用發(fā)生率更低[5-6]。目前普遍認(rèn)為聯(lián)合治療策略既有效又安全。因此，本研究探討較低劑量SIM和SR聯(lián)合治療骨質(zhì)疏松癥可行性，并測試該方法是否可以通過抑制akt/gsk3β/β-catenin/NFATC1途徑抑制破骨細(xì)胞活性和促進成骨細(xì)胞活性。這種方法可以與細(xì)胞水平的主動篩選概念進行比較，以確定有效的藥物組合。旨在更清楚地闡明聯(lián)合藥物治療的機制，為聯(lián)合療法治療骨質(zhì)疏松癥提供理論依據(jù)，也為動態(tài)骨失衡引起的骨代謝疾病的治療奠定基礎(chǔ)。

研究[13]表明，Wnt信號通路在骨健康和疾病發(fā)展中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，它們可以為骨質(zhì)疏松癥的研究和治療提供新的靶點。Wnt/β-catenin信號刺激成骨細(xì)胞增殖，促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進成骨細(xì)胞表達(dá)Osx1，同時抑制脂肪和軟骨形成[14]。此外，Wnt通過β-catenin依賴性和β-catenin非依賴性途徑阻止成熟成骨細(xì)胞的凋亡并延長其生命周期[14]。除了對成骨細(xì)胞的影響外，Wnt/β-catenin信號還刺激護骨素的產(chǎn)生和分泌，以減少破骨細(xì)胞的分化[15]。最近的研究[15]還表明，破骨細(xì)胞中β-catenin的失活可以增加破骨細(xì)胞數(shù)量和骨吸收，從而減少骨量。在調(diào)節(jié)GSK3β/NFATC1的AKT信號通路中，發(fā)現(xiàn)抑制PI3K可以下調(diào)NFATC1的表達(dá)，影響小鼠的破骨細(xì)胞分化，從而影響骨量和骨強度[16]。這些研究表明AKT-GSK3-β-β-catenin-NFATC1信號通路在骨質(zhì)疏松的治療中起著關(guān)鍵作用。

本實驗結(jié)果表明，SIM和SR單獨使用以及SIM和SR聯(lián)合使用對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信號通路的影響是一致的。此外，SIM和SR聯(lián)合的作用明顯大于單獨使用任何一種藥物。最近的研究[17]表明，成骨細(xì)胞中NFATC1表達(dá)的降低增加了成骨細(xì)胞的成骨活性，而破骨細(xì)胞中NFATC1表達(dá)的降低了這些細(xì)胞的骨吸收能力。這些觀察表明，SIM和SR聯(lián)合使用不僅促進骨形成，抑制骨吸收，而且在治療骨質(zhì)疏松方面也比單獨使用這兩種化合物更有效。

本研究試圖確定SIM和SR聯(lián)合使用是否可以促進成骨細(xì)胞活性和抑制破骨細(xì)胞活性，以及其效果是否優(yōu)于單獨使用這兩種藥物中的任何一種。因此，觀察了礦化結(jié)節(jié)的形成和成骨細(xì)胞的ALP活性以及破骨細(xì)胞的吸收能力和TRACP活性。SR在一定程度上增加成骨細(xì)胞的活性，但SIM與SR聯(lián)合使用時，成骨細(xì)胞的ALP活性增加更為顯著。此外，與單獨使用SIM或SR相比，礦化結(jié)晶的形成明顯增強。與單獨SIM或SR使用相比，SIM聯(lián)合SR干預(yù)更顯著降低TRACP活性，顯著減少破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收。雖然SIM聯(lián)合SR的劑量是單獨使用藥物劑量的一半，但聯(lián)合使用的細(xì)胞實驗效果明顯大于單獨使用任何一種化合物的效果。

總的來說，SIM聯(lián)合SR治療是一種潛在的治療骨質(zhì)疏松癥的方案，但還需要進一步行體內(nèi)研究確定。