陳明洲 李朝旭 貴鵬 劉繼鴻 王龍 徐渠

1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 桂林 541004 2.廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院創(chuàng)傷手外科，廣西 桂林 541002

R-spondins由2002年發(fā)現(xiàn)于10～12 d小鼠胚胎頂板和神經(jīng)上皮表達(dá)的R-spondin 1及之后發(fā)現(xiàn)R-spondin 2、R-spondin 3、R-spondin 4組成，對(duì)R-spondin家族的作用一直存在著爭(zhēng)議。隨著R-spondin家族受體LGR 4/5/6、ZNRF3/RNF43、HSPGs和IQGAP1的發(fā)現(xiàn)，R-spondins增強(qiáng)WNT/β-catenin信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、器官穩(wěn)定、干細(xì)胞自我更新中的作用被予以證實(shí)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)R-spondins通過(guò)WNT/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞參與胚胎骨發(fā)育、成體骨形成和骨關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生發(fā)展，對(duì)R-spondins的研究可能成為骨代謝疾病新的治療方向。本文將對(duì)R-spondins增強(qiáng)WNT/β-catenin信號(hào)通路的相關(guān)機(jī)制及其對(duì)胚胎骨發(fā)育、成體骨形成、骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)炎的影響做一綜述。

1 WNT/β-catenin信號(hào)通路

WNT信號(hào)通路是指富含半胱氨酸的分泌糖蛋白WNTs家族與受體結(jié)合進(jìn)而激活一系列細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要細(xì)胞通路[1]。WNT信號(hào)通路能協(xié)調(diào)多細(xì)胞生物胚胎發(fā)育、維持成體組織器官穩(wěn)定，而異常的WNT信號(hào)通路與多種遺傳性疾病、代謝性疾病、腫瘤等疾病密切相關(guān)[2-3]。WNT信號(hào)通路分為依賴β-catenin的WNT/β-catenin信號(hào)通路(又稱經(jīng)典WNT 通路)和不依賴β-catenin的非經(jīng)典 WNT通路。相比于WNT/β-catenin信號(hào)通路，非經(jīng)典通路更加復(fù)雜。主要包括WNT/PCP(planner cell polarity)通路、WNT/Ca2+通路和其他非β-catenin/TCF依賴的通路[4-5]。

在WNT/β-catenin信號(hào)通路中，對(duì)β-catenin的調(diào)控處于中心地位。腺瘤樣結(jié)腸息肉蛋白(adenomatosis polyposis coli，APC)、骨架蛋白(axin)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶GSK3(glycogen synzhase kinase 3)和CK1(casein kinase 1)、低密度脂蛋白5/6(low density lipoprotein receptor-related proteins 5/6，LGP5/6)、T細(xì)胞因子(T-cell factor，TCF)轉(zhuǎn)錄因子均是WNT/β-catenin信號(hào)通路的重要成員。

當(dāng)無(wú)WNTs刺激時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)的“破壞復(fù)合物”(由APC/axin/GSK3和CK1組成)中的GSK3和CK1會(huì)磷酸化β-catenin，磷酸化的β-catenin會(huì)被蛋白酶體降解，WNT/β-catenin信號(hào)通路隨之關(guān)閉。當(dāng)存在WNTs刺激時(shí)，WNTs與細(xì)胞膜上七次跨膜Frizzld受體和LRP5/6共受體同時(shí)結(jié)合，導(dǎo)致了“破壞復(fù)合物”解體，從而抑制β-catenin的降解，胞質(zhì)內(nèi)β-catenin增加，進(jìn)而轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與TCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活WNT/β-catenin信號(hào)通路[1-2]。

2 WNT/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控蛋白R(shí)-spondins

2.1 R-spondins組成及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

R- spondins是包含TSR-1結(jié)構(gòu)域的超家族成員，包括R-spondin1、R-spondin 2、R-spondin 3和R-spondin 4四種分泌糖蛋白成員。這些蛋白的分子量大約為35 kDa，它們60 %的氨基酸序列和保守結(jié)構(gòu)區(qū)域是相同的，四種R-spondin都含有三個(gè)相似的特殊保守結(jié)構(gòu)域：氨基末端的兩個(gè)富含半胱氨酸的Furin結(jié)構(gòu)域、TSR-1結(jié)構(gòu)域、羧基末端富含堿性氨基酸的結(jié)構(gòu)域[6]。TSR-1結(jié)構(gòu)域可能與蛋白多糖結(jié)合有關(guān)，兩個(gè)Furin結(jié)構(gòu)域則可分別與ZNRF3/RNF43、LGR4/5/6結(jié)合從而介導(dǎo)調(diào)控WNT/β-catenin信號(hào)通路[7]。

2.2 R-spondins增強(qiáng)WNT/β-catenin信號(hào)通路的相關(guān)機(jī)制

研究[8]發(fā)現(xiàn)LGR4/5/6是R-spondins的高親和受體。ZNRF3/RNF43通過(guò)泛素化和后續(xù)的串聯(lián)反應(yīng)可降解WNT信號(hào)通路細(xì)胞表面Frizzld受體，發(fā)揮WNT信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[9-10]。

Hao等[11]提出了R-spondins-LGR4/5-ZNRF3/RNF43信號(hào)傳導(dǎo)單元調(diào)控WNT/β-catenin信號(hào)通路的機(jī)制。WNTs與LRP4/5/受體和Frizzld共受體同時(shí)結(jié)合通過(guò)WNT/β-catenin信號(hào)通路，使胞質(zhì)內(nèi)β-catenin增加，進(jìn)而轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與TCF轉(zhuǎn)錄因子作用，激活ZNRF3/RNF43基因表達(dá)ZNRF3/RNF43并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上。當(dāng)沒(méi)有R-spondins存在時(shí)，細(xì)胞膜上的ZNRF3/RNF43通過(guò)胞質(zhì)內(nèi)的接頭蛋白(dishevelled，DVL)識(shí)別Frizzld受體，誘導(dǎo)Frizzld受體泛素化和降解，從而抑制WNT/β-catenin信號(hào)通路。當(dāng)R-spondins存在時(shí)，R-spondins與其受體LGR4/5和細(xì)胞膜ZNRF3/RNF43同時(shí)結(jié)合，誘導(dǎo)ZNRF3/RNF43泛素化和降解，進(jìn)而阻斷Frizzld受體泛素化和降解，增強(qiáng)WNT/β-catenin信號(hào)通路[8-11]。R-spondins-LGR4/5-ZNRF3/RNF43信號(hào)傳導(dǎo)單元保證了WNT/β-catenin信號(hào)通路穩(wěn)定，參與維持消化道干細(xì)胞的自我更新和分化，促進(jìn)消化上皮損傷修復(fù)和腺體再生[12-14]。此外，在ZNRF3/RNF43降解的基礎(chǔ)上，R-spondins-LGR4還可以通過(guò)招募IQGAP1來(lái)誘導(dǎo)LRP5/6磷酸化增強(qiáng)β-catenin活性，提高WNT/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和遷移能力[15]。

目前已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道[16]發(fā)現(xiàn)R-spondin1-4在增強(qiáng)WNT/β-catenin信號(hào)中對(duì)LGRs有不同的需求，特別是R-spondin 2和R-spondin 3在沒(méi)有LGRs的情況下也能夠增強(qiáng)WNT/β-catenin信號(hào)通路。R-spondin 2/3可通過(guò)與HSPGs和ZNRF3/RNF43相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面ZNRF3/RNF43降解來(lái)增加Frizzld受體積累，增強(qiáng)WNT信號(hào)通路[17]。在敲除LGRs的體細(xì)胞中R-spondin 2和R-spondin 3仍可以增強(qiáng)WNT信號(hào)通路。在小鼠和爪蟾胚胎發(fā)生過(guò)程中，伴隨著LGR4、LGR5和LGR6受體的丟失并不表現(xiàn)為R-spondin 2或R-spondin 3相關(guān)表型的丟失[18]。以上報(bào)道各自獨(dú)立而又相互證明了R-spondin 2和R-spondin 3或許不需要LGR4/5/6參與，發(fā)揮抑制RNF43/ZNRF3增強(qiáng)WNT信號(hào)通路的分子機(jī)制。在病理情況下，由于R-spondins基因融合突變、轉(zhuǎn)錄因子異常激活，R-spondins通過(guò)上述機(jī)制中LGR 4/ 5/6、ZNRF3/RNF43、HSPGs、IQGAP1相關(guān)因子參與乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌、骨髓瘤等多種腫瘤的進(jìn)程[19-23]。

3 R-spondins在骨骼發(fā)育和骨相關(guān)疾病中的作用

3.1 R-spondins對(duì)胚胎骨發(fā)育的影響

R-spondins廣泛表達(dá)于小鼠顱面骨、四肢骨和軀干骨胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期[7]，R-spondin 2基因敲除小鼠觀察到其下肢遠(yuǎn)端趾骨和腓骨、上肢遠(yuǎn)節(jié)指骨和橈骨丟失同時(shí)伴有腭裂和顱面畸形，有趣的是相似的骨骼發(fā)育缺陷也出現(xiàn)在干擾WNT/β-catenin信號(hào)通路的小鼠模型中，盡管R-spondin 3基因敲除小鼠無(wú)明顯的骨骼異常，但在R-spondin 2和R-spondin 3雙基因敲除的小鼠中檢測(cè)到更嚴(yán)重的骨骼畸形，表明R-spondin 2和R-spondin 3在功能上有一定程度的重疊[24]。Szenker-Ravi等[18]通過(guò)對(duì)5組人類家庭的11個(gè)肢體畸形胎兒的研究發(fā)現(xiàn)，R-spondin 2基因突變的4個(gè)胎兒表現(xiàn)為橈骨、脛骨缺失伴或不伴肱骨、股骨發(fā)育不良，以及胚胎前軸側(cè)手指缺失，其他7個(gè)胎兒表現(xiàn)為部分Tetra-amelia綜合征(四肢完全缺失、肺發(fā)育不全、唇腭裂和唇腭溝發(fā)育不全)，這與敲除小鼠R-spondin 2基因畸形相似。另外人類手掌、足跖部分區(qū)域皮膚角化過(guò)度異常增厚與R-spondin1基因的突變相關(guān)，R-spondin 4基因錯(cuò)位與人類常染色體隱型疾病四肢指甲缺失高度相關(guān)[6]，這些過(guò)程最有可能通過(guò)激活WNT/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

3.2 R-spondins對(duì)成體骨發(fā)育的影響

成骨細(xì)胞的成骨同破骨細(xì)胞的骨吸收之間保持平衡對(duì)成體骨的維持和重建至關(guān)重要，研究證實(shí)WNT/β-catenin信號(hào)通路影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的生物學(xué)行為，在骨合成代謝方面具有重要作用[25]。Sharma等[26]發(fā)現(xiàn)在人類原代成骨細(xì)胞和人類成骨祖細(xì)胞系FOB 1.19細(xì)胞的分化過(guò)程中，R-spondin1表達(dá)增加。在FOB 1.19細(xì)胞中，敲除R-spondin 1導(dǎo)致堿性磷酸酶活性降低而轉(zhuǎn)染R-spondin1，通過(guò)激活WNT/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，提高堿性磷酸酶活性。相似的結(jié)果在小鼠成骨細(xì)胞模型MC3T3-E1細(xì)胞(成骨前細(xì)胞系)中也得到證實(shí)。這些結(jié)果證明R-spondin1可能通過(guò)自分泌的形式促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的成骨活性。

Zhu等[27]發(fā)現(xiàn)R-spondin 2-LGR4通過(guò)激活WNT/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞(成骨前細(xì)胞系)的分化、成骨并能抑制破骨細(xì)胞的生成，而在小鼠OVX模型(雌激素缺乏導(dǎo)致進(jìn)行性骨質(zhì)疏松小鼠模型)體內(nèi)試驗(yàn)中，外源性R-spondin 2改善了OVX小鼠脛骨近端的骨丟失和骨小梁結(jié)構(gòu)，同時(shí)促進(jìn)小鼠骨形成，增加骨質(zhì)量。Knight等[28]則通過(guò)對(duì)R-spondin 2基因敲除導(dǎo)致肢體發(fā)育缺陷的小鼠模型以及構(gòu)建完全敲除R-spondin 2基因的小鼠模型研究，發(fā)現(xiàn)R-spondin 2調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的生成和礦化，破壞R-spondin 2表達(dá)干擾骨骼礦物質(zhì)沉積、骨骼形成，導(dǎo)致骨量減少和骨強(qiáng)度下降。另外破壞R-spondin 2小鼠特殊骨骼表型與干擾LGR5/6的WNT/β-catenin信號(hào)通路表型相似，對(duì)敲除R-spondin 2小鼠的分析也發(fā)現(xiàn)了WNT/β-catenin信號(hào)通路的抑制。

軟骨細(xì)胞在軟骨骨化過(guò)程中按靜止軟骨區(qū)域、增殖軟骨細(xì)胞區(qū)域、軟骨細(xì)胞成熟/肥大區(qū)域順序分化，然后被成骨細(xì)胞取代。在增殖軟骨區(qū)域的軟骨細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Sox 9，分泌II型膠原(collagen type II，CII)和蛋白聚糖(aggrecan，Acan)等基質(zhì)蛋白[29]，成熟/肥大區(qū)域的軟骨細(xì)胞則表達(dá)另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Runx 2[30]。Takegami等[31]發(fā)現(xiàn)R-spondin 2基因敲除的小鼠模型中軟骨細(xì)胞的β-catenin的含量減少，而Sox 9和CII的含量增加。通過(guò)對(duì)ATDC 5軟骨細(xì)胞系R-spondin 2的過(guò)表達(dá)和敲除對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)R-spondin 2激活WNT/β-catenin信號(hào)通路抑制增殖軟骨細(xì)胞Col2a1、Sox 9、Acan表達(dá)但不抑制成熟/肥大軟骨細(xì)胞Runx 2表達(dá)。支持R-spondin 2激活軟骨細(xì)胞WNT/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中增殖軟骨細(xì)胞向肥大軟骨細(xì)胞分化。體內(nèi)外試驗(yàn)均表明R-spondin 2是一種有效的骨代謝正向調(diào)控因子。

Moayyeri等[32]通過(guò)對(duì)人類足跟骨定量超聲和足跟骨平片全基因組相關(guān)研究的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，R-spondin 3基因與人類骨密度和骨折風(fēng)險(xiǎn)存在顯著關(guān)聯(lián)性，暗示R-spondin 3可能參與骨代謝。

3.3 R-spondins對(duì)骨代謝疾病的影響

廢用性骨質(zhì)疏松癥是由于骨骼缺少機(jī)械刺激而導(dǎo)致骨量減少，普遍存在于骨折固定、神經(jīng)肌肉疾病或脊髓損傷等長(zhǎng)期患肢制動(dòng)的患者中[33]。Shi等[34]發(fā)現(xiàn)R-spondin 1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化的過(guò)程中動(dòng)態(tài)表達(dá)，R-spondin1-LGR4通過(guò)激活WNT/β-catenin信號(hào)通路增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和骨形成。在體外連續(xù)循環(huán)機(jī)械拉伸(continuous cyclic mechanical stretch，CMS)機(jī)械刺激下，R-spondin 1在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)增加，而在后肢懸吊(tail suspension，TS)機(jī)械刺激去除小鼠模型中R-spondin 1的表達(dá)下降。過(guò)表達(dá)R-spondin 1可顯著改善TS小鼠的骨量丟失。R-spondin 1是一種機(jī)械刺激敏感蛋白，R-spondin 1-LGR4是潛在的防治廢用性骨質(zhì)疏松癥的靶點(diǎn)。

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是以關(guān)節(jié)軟骨的退行性變和關(guān)節(jié)周圍繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，疼痛、功能障礙和畸形是其主要的臨床表現(xiàn)[35]。Okura等[36]發(fā)現(xiàn)OA患者關(guān)節(jié)滑膜液中R-spondin 2含量隨著OA的嚴(yán)重程度逐漸增加，米安色林可以通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞中R-spondin 2誘導(dǎo)的WNT/β-catenin信號(hào)通路，改善和預(yù)防內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)膝關(guān)節(jié)OA小鼠模型關(guān)節(jié)軟骨的降解。巨噬細(xì)胞是單核細(xì)胞進(jìn)入外周組織后分化而來(lái)重要免疫細(xì)胞，不同局部微環(huán)境刺激巨噬細(xì)胞可分化成為具有不同功能的表型(即極化)，包括M1 型巨噬細(xì)胞和M2 型巨噬細(xì)胞，它們?cè)跈C(jī)體病原微生物與衰老細(xì)胞的清除、促進(jìn)和抑制炎癥反應(yīng)、誘發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)及損傷組織的修復(fù)與重構(gòu)都發(fā)揮重要作用[37]。Zhang等[38]發(fā)現(xiàn)在OA患者和膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(collagenaseinduced osteoarthritis，CIOA)小鼠模型關(guān)節(jié)滑膜組織中，mTORC1信號(hào)的激活增強(qiáng)了M1型巨噬細(xì)胞極化同時(shí)減弱M2型巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)M1巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌R-spondin 2，促進(jìn)了關(guān)節(jié)軟骨的退化、降解和骨贅生物的形成。誘導(dǎo)的OA在小鼠中的發(fā)展，證實(shí)M1巨噬細(xì)胞和R-spondin 2是OA治療的潛在靶點(diǎn)。

4 結(jié)論與展望

隨著LGR4/5/6、ZNRF3/RNF43、HSPGs、IQGAP1的發(fā)現(xiàn)，R-spondins增強(qiáng)WNT/β-catenin信號(hào)通路的機(jī)制逐漸清晰。在骨骼系統(tǒng)中R-spondins在胚胎骨骼發(fā)育的各個(gè)階段廣泛表達(dá)，R-spondins不但與人類四肢骨骼發(fā)育畸形和缺失密切相關(guān)，而且能夠通過(guò)增強(qiáng)WNT/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)增殖軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化、抑制破骨細(xì)胞的生成，有助于成體骨形成和維持骨密度，有力的證明了R-spondin家族是一種骨代謝正向調(diào)控因子。另外R-spondin 1、R-spondin 2參與廢用性骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎骨代謝疾病的發(fā)展，同時(shí)米安色林通過(guò)抑制R-spondin 2改善骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，也顯示出靶向R-spondins治療骨丟失和骨關(guān)節(jié)炎等相關(guān)骨代謝疾病的潛力。

雖然R-spondins在骨組織中仍然有許多問(wèn)題等待解決，包括R-spondin家族成員種類多樣、功能影響復(fù)雜，對(duì)R-spondins調(diào)控WNT/β-catenin信號(hào)通路的機(jī)制和相關(guān)因子仍需做進(jìn)一步研究。但是對(duì)于R-spondins應(yīng)用于骨合成代謝相關(guān)疾病治療的前景依然值得期待。