朱換平 石敏 張維平 馬同 趙繼榮*

1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050 2.蘭州市城關(guān)區(qū)婦幼保健院，甘肅 蘭州 730030

人類骨代謝平衡通過骨吸收和新骨形成的耦合來維持[1]。當(dāng)破壞骨形成和骨吸收之間的平衡時，骨質(zhì)疏松癥就會發(fā)生[2]。骨質(zhì)疏松癥是最常見的與年齡相關(guān)的慢性疾病之一，隨著年齡的增長，骨轉(zhuǎn)換率逐漸下降，導(dǎo)致骨密度(bone mineral density,BMD)和骨礦物質(zhì)含量(bone mineral content,BMC)逐漸下降[3]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明。有研究[4]表明，骨質(zhì)疏松癥是一種多因素疾病，多種基因和信號通路參與其發(fā)病機(jī)理[5]。p53蛋白由TP53基因編碼，Jia等[6]證明TP53多態(tài)性可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險。Tao Yu等[7]同樣研究發(fā)現(xiàn)，p53在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抑制p53的某些活性可能抑制骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和(或)進(jìn)展。另外，Xie等[8]也發(fā)現(xiàn)TP53在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中起關(guān)鍵作用。杜仲腰痛丸(eucommia lumbago pill，ELP)被證明對骨質(zhì)疏松癥具有治療作用[9]。但ELP是否通過調(diào)控p53影響老年骨質(zhì)疏松癥患者的骨密度、骨代謝，尚無相關(guān)報道。本研究將通過ELP對臨床患者p53的表達(dá)水平的影響及其與骨密度、骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析，同時通過體外細(xì)胞實驗驗證ELP是否通過抑制p53的表達(dá)，促進(jìn)骨形成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1一般資料：選取自2018年3月至2019年8月期間，在甘肅省中醫(yī)院門診就診的老年骨質(zhì)疏松癥患者30例。所有患者均符合WHO對老年骨質(zhì)疏松癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男性12例、女性18例，年齡65～70歲，平均(70.15±2.73)歲。選取同期于本院體檢健康的老年男性10名、女性20名為對照組，年齡65～70歲，平均(70.85±3.26)歲。以上兩組均自愿加入該臨床實驗，且均簽訂知情同意書。排除患有其他骨科疾病、精神疾病及血液病患者，患有嚴(yán)重心肝腎功能損傷患者，對本研究使用藥物過敏的患者。將受試者分為對照組(未患骨質(zhì)疏松癥者30例)、OP組(患骨質(zhì)疏松癥者30例)、ELP組(接受杜仲腰痛丸治療患者30例)。

1.1.2細(xì)胞株：小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1 購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含有15 %胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1藥物治療：給予ELP組患者碳酸鈣D3咀嚼片(鈣爾奇D，600 mg/d，1次/d)、骨化三醇膠丸(羅鈣全，0.25 μg/次，2次/d)+口服杜仲腰痛丸(ELP，8粒/次，3次/d，由甘肅省中醫(yī)院制劑中心提供)，治療后6個月進(jìn)行療效評價。

1.2.2p53過表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染MC3T3-E：根據(jù)Gen-Bank中人p53基因序列，選擇kana抗性的p53基因過表達(dá)載體plRES2-EGFP-p53 WT進(jìn)行陽性克隆、轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞(由廣州輝駿生物科技股份有限公司完成)。

1.2.3ELP培養(yǎng)液配制及細(xì)胞分組：取ELP 20 g(甘肅省中醫(yī)院制劑室生產(chǎn))浸泡 24 h，旺火煮沸30 min，取藥液2次，混合2次藥液，濃縮至20 mL左右。按2∶3 比例加入無水乙醇，靜置 24 h。4 000 r/min分別離心55、11 min，取上清液，水浴濃縮蒸發(fā)干液體，加蒸餾水配制成2、4、8 g/mL ELP 原藥。均用高溫消毒30 min，4 ℃冰柜冷藏。取3份20 mL的DMEM培養(yǎng)液，分別加入2、4、8 g/mL杜仲原藥4 μL，即得含0.2、0.4和0.8 mg/mL ELP培養(yǎng)液(pH 7.2～7.4，滲透壓280～320 mOSM/L)。將細(xì)胞分為對照組(無任何處理)、ELP(0.2、0.4、0.8 mg/mL)組、p53過表達(dá)組、ELP+ p53過表達(dá)組(0.4 mg/mL ELP + p53過表達(dá))。

1.2.4RT-PCR檢測：根據(jù)北京百奧公司的組織細(xì)胞提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA 提取操作。參照Thermo Scientific反轉(zhuǎn)錄說明書，合成cDNA。并以雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對定量法進(jìn)行qPCR定量分析，使用2-ΔΔct法測定p53、ALP、OCN及Runx2 mRNA的相對表達(dá)水平，GAPDH為內(nèi)參。實驗設(shè)置3個平行復(fù)孔，結(jié)果取平均值。引物如表1所示。

表1 實驗中使用的引物Table 1 Primers used in the experiments

1.2.5Western blot檢測：空腹條件下，收集各實驗組外周靜脈血5 mL，3 000 r/min離心20 min后收集上清，用1×PBS稀釋5倍。在16 μL稀釋液中加入上樣緩沖液4 μL，混勻，在沸水浴中煮5 min，10 000 r/min離心3 min，常溫冷卻后等體積上樣，每孔上樣5 μL。用6 % SDS-PAGE凝膠將蛋白分離，恒壓電泳，濃縮膠80 mV，分離膠120 mV。PVDF膜電轉(zhuǎn)印，用5 %脫脂牛奶在室溫條件下封閉1 h，隨后在分別與p53、ALP、OCN及Runx 2(稀釋1∶1 000)一抗在4 ℃條件下孵育過夜，再用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，最后用Image J對條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.6骨密度檢測：采用美國 LUNADPX - MD型雙能X線骨密度分析儀對三組受試者腰椎L2～4、股骨頸(FN)、大轉(zhuǎn)子(GT)、Ward 三角區(qū)的BMD進(jìn)行定量檢測。

1.2.7骨代謝生化指標(biāo)：在空腹條件下，用肝素抗凝采血管收集對照組、OP組及ELP組治療6個月后的外周靜脈血5 mL，用離心機(jī)離心，留取血清，用于檢測骨鈣素(BGP)、骨源性堿性磷酸酶(BALP)及清晨空腹尿酶免法測定尿脫氧吡啶啉/肌酐(DPD/Cr)比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 杜仲腰痛丸對p53表達(dá)的影響

如圖1所示，與對照組(control)相比，OP組受試者血清樣品中P53基因表達(dá)量顯著增加(圖1 A)，相應(yīng)地，OP組中p53蛋白的水平也顯著增加(圖1B)(P<0.01)，表明p53在骨質(zhì)疏松發(fā)展中起著重要作用。杜仲腰痛丸治療6 個月后，p53的mRNA及蛋白的水平均明顯降低(均P<0.01)，提示杜仲腰痛丸可以抑制p53在OP中的表達(dá)。

圖1 p53的mRNA與蛋白的表達(dá)注：A:p53在對照、OP及ELP組治療后血清中mRNA的水平；B：p53在對照、OP及ELP組治療后血清中蛋白的水平。與對照組比較，**P<0.01；與OP組比較，##P<0.01。Fig.1 p53 mRNA and protein expression

2.2 杜仲腰痛丸對BMD的影響

如圖2所示，與對照組相比，OP組BMD顯著降低(P<0.05)，骨量減少。與OP組比較，EPL治療后腰椎L2～4的BMD顯著升高(P<0.01)；而股骨頸(FN)、大轉(zhuǎn)子(GT)及Ward 三角區(qū)的BMD值無顯著變化(P>0.05)。

圖2 腰椎L2～4及股骨頸各部位BMD值的含量注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與OP組比較，##P<0.01。Fig.2 The content of BMD in lumbar spine L2-4 and femoral neck

2.3 骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)的比較

如表2所示，與OP組相比，ELP組治療6個月后受試者的BGP、TRAP及DPD/CR 水平均明顯降低，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。提示杜仲腰痛丸能更有效地改善老年骨質(zhì)疏松癥的骨代謝水平。

表2 三組受試者BGP、BALP、DPD/CR的比較Table 2 Comparison of BGP,BALP,DPD/CR of three groups

2.4 p53的表達(dá)與L2～4BMD、BGP、BALP及DPD/CR含量的相關(guān)性

如圖3所示，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)ELP組治療后p53的表達(dá)水平較OP組顯著降低，而L2～4BMD含量顯著升高，兩者在P<0.01水平上呈顯著負(fù)相關(guān)，同時與骨代謝生化指標(biāo)BGP、BALP及DPD/CR含量在P<0.01水平上呈顯著正相關(guān)。相關(guān)性分析表明杜仲腰痛丸可能通過抑制p53的表達(dá)影響老年骨質(zhì)疏松癥患者的骨密度和骨代謝水平。

圖3 ELP治療后p53的表達(dá)與L2～4BMD、BGP、BALP及DPD/CR含量的相關(guān)性注：A：與BMD含量的相關(guān)性；B與BGP含量的相關(guān)性；C：與BALP含量的相關(guān)性；D：與DPD/CR含量的相關(guān)性。Fig.3 Correlation of p53 expression with L2-4BMD,BGP,BALP and DPD/CR content after ELP treatment

2.5 杜仲腰痛丸對成骨細(xì)胞MC3T3-E1中p53表達(dá)的影響

如圖4所示，與對照組相比，用0.2、0.4、0.8 mg/mL的ELP提取液處理MC3T3-E1 24 h后，MC3T3-E1中p53的表達(dá)明顯降低，且0.4 mg/mL的ELP提取液對p53的表達(dá)影響最為顯著(P<0.05)。提示ELP提取液可以抑制MC3T3-E1中p53的表達(dá)。

圖4 ELP處理后p53的表達(dá)水平注：與對照組比較,**P<0.05。Fig.4 p53 expression level after ELP treatment

2.6 杜仲腰痛丸逆轉(zhuǎn)p53過表達(dá)對成骨分化的抑制

如圖5所示，與p53過表達(dá)組相比，杜仲腰痛丸提取液處理的MC3T3-E1中p53的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖5 A。此外，與對照組比較，p53過表達(dá)顯著降低MC3T3-E1中ALP、OCN及Runx 2的mRNA及蛋白表達(dá)水平，且0.4 mg/mL的杜仲腰痛丸提取液處理可以逆轉(zhuǎn)p53過表達(dá)的影響，顯著增加ALP、OCN和Runx 2表達(dá)(P<0.05)，見圖5B、圖5C。提示杜仲腰痛丸提取液可以抑制MC3T3-E1中p53的表達(dá)，促進(jìn)骨形成。

圖5 p53、ALP、OCN及Runx 2的表達(dá)水平注：A：qRT-PCR檢測各組p53表達(dá)情況；B、C：qRT-PCR和western blot檢測各組成骨基因的表達(dá)。與對照組比較,**P<0.01；與p53過表達(dá)組比較，##P<0.01。Fig.5 Expression levels of p53,ALP,OCN and Runx 2

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后婦女和老年人常見的一種廣泛的代謝性骨病[10]。骨質(zhì)疏松癥可引起疼痛、脊柱畸形和骨折，甚至可能增加死亡風(fēng)險[11]。因此，骨質(zhì)疏松癥已成為世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題，給患者和醫(yī)療系統(tǒng)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[12]。故對其治療及機(jī)理的研究顯得尤為重要。杜仲腰痛丸是由甘肅中醫(yī)院研究的經(jīng)驗效方，在治療OP中具有平衡骨代謝、緩解疼痛、消炎消腫等功效[9]。但是，尚不清楚杜仲腰痛丸對骨骼健康影響的詳細(xì)機(jī)制。

研究[13]發(fā)現(xiàn)多種基因參與OP的發(fā)病機(jī)理。Liu等[14]報道了p53通過miRNA信號通路影響MSC的功能來抑制成骨作用。本研究結(jié)果顯示，p53 參與OP的發(fā)病，且杜仲腰痛丸可以抑制p53的表達(dá)影響老年骨質(zhì)疏松癥患者的骨密度和骨代謝水平。

筆者還進(jìn)行了一項體外研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p53過表達(dá)顯著降低MC3T3-E1中骨相關(guān)基因mRNA以及蛋白的表達(dá)水平，但杜仲腰痛丸提取液處理可以逆轉(zhuǎn)p53過表達(dá)的影響及ALP、OCN和Runx 2表達(dá)(P<0.05)。提示p53過表達(dá)抑制骨形成，杜仲腰痛丸提取液可以逆轉(zhuǎn)p53的抑制作用，促進(jìn)骨形成。相關(guān)動物研究[15]也表明下調(diào)p53的表達(dá)，可以促進(jìn)骨形成，糾正OP大鼠的骨代謝失衡狀態(tài)。Wang等[16]的研究表明，p53-/-小鼠的成骨細(xì)胞功能增強(qiáng)，呈現(xiàn)高骨量表型，而p53-/-成骨細(xì)胞具有增強(qiáng)的促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的能力，此外，滅活p53足以挽救在缺乏c-Abl(一種與p53相互作用的蛋白)的小鼠中觀察到的成骨細(xì)胞分化缺陷。因此，p53是成骨細(xì)胞形成、成骨細(xì)胞依賴性破骨細(xì)胞形成和骨重塑的負(fù)調(diào)控因子。Fujita等[17]的研究同樣表明，p53 基因可以通過影響OPG、RANKL和M-CSF的表達(dá)使成骨-破骨失衡。在p53 基因缺陷的成骨細(xì)胞中，可以顯示出成骨細(xì)胞依賴的破骨細(xì)胞活性增加。以上研究證實p53 基因?qū)切纬傻囊种谱饔?，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，p53的表達(dá)與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病進(jìn)展密切相關(guān)，且杜仲腰痛丸可以抑制p53的表達(dá)，從而影響老年骨質(zhì)疏松癥患者的骨密度和骨代謝水平。體外研究進(jìn)一步表明，p53過表達(dá)對成骨分化的抑制作用，而杜仲腰痛丸提取液可以逆轉(zhuǎn)p53對成骨分化的抑制作用，促進(jìn)骨形成，因此可以作為潛在的治療骨質(zhì)疏松癥藥物。當(dāng)然，本研究還需大量的基礎(chǔ)研究、其他研究來比較杜仲腰痛丸及其他藥物對骨質(zhì)疏松癥發(fā)展的影響。