胡旭峰

皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院/弋磯山醫(yī)院，安徽 蕪湖 241000

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性疾病，其特征是骨量減少和骨折風(fēng)險增加，嚴重影響中老年人的健康[1]。骨吸收和骨形成動態(tài)失去平衡是骨質(zhì)疏松癥的根本原因。骨重建是一個生理過程，其中成骨細胞形成新的骨骼，而破骨細胞重新吸收原始的骨基質(zhì)，對維持成人骨骼健康起到關(guān)鍵作用，多種因素參與調(diào)節(jié)這一過程[2]。雙膦酸鹽、雌激素和雷洛昔芬通常用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，盡管這些藥物可顯著增加骨量，但它們具有一些局限性和副作用，包括血栓栓塞和胃腸道刺激[3]。阿魏酸(ferulic acid)是存在于多種水果中的天然多酚類藥物，對高血壓和胰島素抵抗有治療作用[4]。據(jù)報道[5-6]，阿魏酸不僅具有抗氧化劑活性，還能抑制成熟破骨細胞的融合和凋亡。有學(xué)者還報道[7]了補充阿魏酸可預(yù)防鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病大鼠脂質(zhì)過氧化。這些結(jié)果顯示出阿魏酸可能對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥引起的骨丟失有保護作用。因此，本研究使用去卵巢模型初步探索阿魏酸治療骨質(zhì)疏松癥的可行性，并研究其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

選取30只體重220～260 g、3月齡雌性SD大鼠 (購自上海實驗動物中心)作為實驗動物。每5只大鼠飼養(yǎng)在一個籠子里，光照時間為12 h/d，溫度為25 ℃，通風(fēng)干燥；可以自由飲食，食物是標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，含有2.5 %酪蛋白、0.8 %磷、1 %鈣、70 %～80 %碳水化合物和5 %脂肪。適應(yīng)1周后，10只大鼠接受假手術(shù)(Sham)，其余大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)(OVX)。手術(shù)3 d后將大鼠分為3組(每組10只)：Sham組：假手術(shù)大鼠，給予生理鹽水[(50 mL/(kg·d)]灌胃；OVX組：去卵巢大鼠，給予生理鹽水[(50 mL/(kg·d)]灌胃；阿魏酸組：去卵巢大鼠,給予阿魏酸(20 mg/kg，Sigma-Aldrich)灌胃治療,1次/d，共12周；藥物劑量參考文獻[7]。治療結(jié)束時通過過量水合氯醛麻醉處死大鼠，獲取其雙側(cè)股骨行進一步檢測。并從大鼠左心室收集血液樣本(1 mL/只)，在4 ℃下以2 500 r/min 離心10 min來分離血清樣品，置于- 80 ℃下保存，備用。本研究得到皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(20191211)。

1.2 方法

1.2.1Micro-CT檢測：應(yīng)用Micro-CT CT50成像系統(tǒng)(Micro-CT CT50，Sanco Medical)評價大鼠左側(cè)股骨遠端的微觀結(jié)構(gòu)。感興趣體積(VOI)包括從生長板最高點以下2.0 mm到遠端100層的骨小梁平掃圖片。對VOI區(qū)三維圖像進行定性和定量分析獲取骨體積百分比(BV/TV)、平均骨小梁厚度(Tb.Th)、平均骨小梁數(shù)目(Tb.N)、平均骨小梁間距(Tb.Sp)和骨密度(bone mineral density,BMD)。待Micro-CT掃描后，使用10 %乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，每周更換2次，連續(xù)4周，然后用分級乙醇系列(70 %～100 %)脫水。隨后進行石蠟包埋，長軸平行于基面。切取厚度為4 mm的縱向連續(xù)切片，固定在涂有聚賴氨酸的顯微鏡載玻片上，進行HE染色。染色方法按照制造商提供的方案進行，并在顯微鏡(奧林巴斯DP71顯微鏡，奧林巴斯公司)下檢查。

1.2.2血清生化檢測：根據(jù)制造商提供的方案，使用ELISA試劑盒(目錄號F8956和F18955；Westang Biological Technology Co.，Ltd.)檢測之前保存的血清樣品，檢測項目包括P1NP和TRACP-5b在內(nèi)的骨代謝血清標(biāo)志物。

1.2.3骨生物力學(xué)實驗：對大鼠股骨進行三點彎曲以確定股骨最大負荷和剛度。將左側(cè)股骨放在力學(xué)測試裝置上。將股骨放在支架的中間位置，以10 mm/min的持續(xù)測試速度加載直到股骨骨折。記錄數(shù)據(jù)，最后進行分析以獲得極限載荷(N)和彈性模量(mm2)。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡檢測：將股骨遠端在液氮中碎裂，并用放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液裂解。離心后，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測量上清液中的蛋白質(zhì)水平。將每種蛋白質(zhì)樣品(60 μg)裝入10 %(0.1 g /mL)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。然后，將膜用5 %(0.05 g/mL)牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉1 h，并與相對應(yīng)的一抗(BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8、GAPDH)在4 ℃下過夜，然后在室溫下放置相應(yīng)的二抗1 h，并用TBST(Tris-HCl 10 mmol/L，氯化鈉 150 mmol/L，Tween-20 0.05%(v/v);pH=7.5)洗滌3次。蛋白質(zhì)表達信號通過增強的化學(xué)發(fā)光發(fā)光液可視化，并使用Tanon系統(tǒng)捕獲圖像。印跡的灰度值使用ImageJ軟件進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計分析用SPSS 22.0軟件進行。基于方差結(jié)果的同質(zhì)性檢驗，使用Student’st檢驗比較兩個不同組間差異。以P<0.05判斷差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織切片分析

股骨干骺端骨小梁的HE染色如圖1所示。Sham組顯示股骨干骺端骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)正常；OVX組表現(xiàn)為疏松均勻的骨小梁變薄，導(dǎo)致骨小梁間隙變寬；阿魏酸組骨小梁數(shù)量和連接增加明顯，表現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)恢復(fù)。

圖1 三組股骨的組織病理學(xué)注：A：Sham組；B：OVX組；C：阿魏酸組。HE染色(放大倍數(shù)，×40)。Fig.1 Histopathology of femurs in the three groups

2.2 阿魏酸治療對大鼠股骨骨小梁結(jié)構(gòu)影響

股骨干骺端骨小梁三維重建圖像如圖2 A所示。股骨干骺端的微觀參數(shù)如圖2B～圖2F所示。OVX組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)；阿魏酸組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp則明顯低于OVX組(P<0.05)。

圖2 三組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結(jié)果注：A：三組大鼠骨小梁三維重建；B：骨密度；C：Tb.Th；D：Tb.Sp；E：Tb.N;F：BV/TV;a:Sham組;b:OVX組;c:阿魏酸組。與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05。Fig.2 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of the three groups of rats

2.3 阿魏酸治療對大鼠骨代謝指標(biāo)的影響

阿魏酸治療對骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的影響見圖3。與Sham組相比，OVX組P1NP和TRACP-5b水平顯著升高(P<0.05)；與OVX組相比，阿魏酸組骨代謝指標(biāo)P1NP和TRACP-5b水平顯著降低(P<0.05)。

圖3 阿魏酸治療對骨代謝指標(biāo)的影響注：A：P1NP；B：TRACP-5b。與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05。Fig.3 Effect of Ferulic acid treatment on the bone metabolism indexes

2.4 阿魏酸治療對大鼠股骨生物力學(xué)的影響

股骨三點彎曲試驗如圖 4所示，OVX組的極限載荷和彈性模量均顯著低于Sham組，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，阿魏酸組的極限載荷和彈性模量較OVX組明顯升高(P<0.05)。

圖4 右股骨的三點彎曲試驗結(jié)果注：A:極限載荷；B:彈性模量。與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05。Fig.4 Three-point bending test results of the right femur of rats

2.5 阿魏酸治療對BMP2/Smads信號通路的影響

與Sham組比較，OVX組BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8表達水平明顯下調(diào)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與OVX組比較，阿魏酸組BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8表達水平上調(diào)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 使用WB檢測BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8和GAPDH的相對表達注：A：各組目標(biāo)蛋白的表達：B：BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8表達；與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05。Fig.5 Relative expression of BMP-2,Smad1,Smad4,p-Smad1/5/8 to GAPDH using Western blotting

3 討論

目前臨床上用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物以雙膦酸鹽、雌激素受體調(diào)節(jié)劑或者甲狀旁腺素(1-34)為主[8]。盡管這些藥物都有一定的療效，但它們也存在不同程度的局限性。骨質(zhì)疏松癥治療的目的是恢復(fù)骨骼的正常代謝，即增強成骨功能并減少由于骨質(zhì)疏松癥的病理性骨吸收而導(dǎo)致的骨強度降低。OVX大鼠和絕經(jīng)后女性的雌激素缺乏相似，均出現(xiàn)BMD降低[9-10]。在本研究中，阿魏酸治療可顯著改善BMD，并有效防止OVX誘導(dǎo)的雌激素缺乏引起的骨量流失。

本研究中的生物力學(xué)測試表明，與Sham組相比，OVX組大鼠股骨骨折所需的力量較小。阿魏酸治療顯著改善了去卵巢大鼠股骨生物力學(xué)性能。骨強度與骨密度、結(jié)構(gòu)、連通性和礦化有關(guān)[11]。本研究的結(jié)果與以前研究的結(jié)果一致，卵巢切除術(shù)導(dǎo)致BMD降低以及生物力學(xué)強度顯著降低[12]。

骨質(zhì)疏松癥的主要原因是骨吸收與骨形成之間的不平衡。健康的骨骼需要保持成骨細胞和破骨細胞之間的動態(tài)平衡，以進行適當(dāng)?shù)墓趋乐厮躘13]。血清骨代謝指標(biāo)的變化反映了骨骼代謝的平衡。這些變化可用于評估骨轉(zhuǎn)化，并客觀地反映骨吸收和骨形成。TRACP-5b是破骨細胞分泌的細胞因子，在骨重塑中起重要作用。P1NP被認為是骨轉(zhuǎn)換的標(biāo)志，由成骨細胞分泌，在成骨細胞分化和骨形成活性中起著重要的作用。本研究結(jié)果表明，與Sham組大鼠相比，OVX組大鼠的P1NP和TRAP-5b水平顯著升高。使用阿魏酸治療12周后能顯著降低P1NP和TRACP-5b水平，表明阿魏酸具有糾正骨吸收與骨形成之間不平衡的能力。

BMPs是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的成員。幾項研究[14-15]表明，BMPs可以激活Smad蛋白家族的下游信號分子，刺激間充質(zhì)細胞分化，并不可逆地誘導(dǎo)骨骼和軟骨的形成。BMP-2可通過經(jīng)典的BMP/Smad途徑調(diào)節(jié)成骨細胞分化。該信號傳導(dǎo)途徑由II型BMP受體啟動，激活后通過磷酸化BMP特異性Smad1、Smad5和Smad8傳播BMP信號。然后，p-Smad1/5/8與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物易位至細胞核并激活或抑制成骨基因的轉(zhuǎn)錄。BMP/Smads信號通路的激活是調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化和抑制破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收在骨重塑中的重要調(diào)控機制[16]。本研究發(fā)現(xiàn)OVX組的BMP-2、Smad1、Smad4和p-Smad1/5/8表達水平較Sham組顯著降低，表明OVX組大鼠BMP/Smads信號通路的被抑制，而在經(jīng)過阿魏酸治療后，BMP-2、Smad1、Smad4和p-Smad1/5/8較OVX組顯著上調(diào)，這表明BMP/Smads信號通路已經(jīng)被激活，最終出現(xiàn)一系列信號傳導(dǎo)導(dǎo)致骨代謝失衡糾正，骨量和骨強度增加。

綜上所述，本研究表明阿魏酸能夠改善去卵巢大鼠的骨量丟失，而這種結(jié)果可能是由BMP/Smads信號通路激活而介導(dǎo)的。由于骨質(zhì)疏松癥機制復(fù)雜，本研究只是初步證實了阿魏酸具有抗骨質(zhì)疏松癥的潛力，需要進一步擴大樣本量和研究時間來證實藥物的有效性與安全性。