尚延春 張海英 柴巍巍

河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院),河南 鄭州 450000

骨質(zhì)疏松癥是常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病，可增加全身骨折的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，我國(guó)50歲以上居民的骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率已高達(dá)19.2 %，且呈上升趨勢(shì)。目前治療骨質(zhì)疏松癥的常用藥物有雙膦酸鹽、降鈣素、雌激素等[2]，雖有一定作用但副作用大，仍需優(yōu)化。異補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂的重要成分，被證實(shí)具有抗骨質(zhì)疏松作用[3]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[4]，核心結(jié)合因子α1(core binding factor α 1，Runx 2)/人基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP13)信號(hào)通路可參與骨質(zhì)疏松大鼠骨組織破壞病變。但是異補(bǔ)骨脂素是否能通過(guò)上述信號(hào)通路途徑治療骨質(zhì)疏松癥尚未可知。鑒于此，本研究將設(shè)計(jì)進(jìn)行大鼠對(duì)照試驗(yàn)以探討上述問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：50只SD大鼠，均為雌性，7周齡，180～220 g，平均(205.42±10.12)g，SPF級(jí)，均購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(豫)20180001。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物：異補(bǔ)骨脂素干粉，購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度≥98 %。

1.1.3試劑與儀器：維酸鉀購(gòu)自博士德生物工程有限公司；血鈣甲基百里酚藍(lán)(methyl thymol blue，MTB)法檢測(cè)試劑盒、血磷鉬酸法測(cè)定試劑盒、血清骨鈣素(bone gla protein，BGP)、尿膠原砒啶交聯(lián)N末端肽(N-terminal telopeptides of typeⅠcollagen，NTX)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)OXTEX公司；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、脫氧核苷酸(deoxynucleotide，DNA)提取試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；兔抗鼠Runx 2、MMP13單克隆抗體、山羊抗兔Runx 2、MMP13多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；Runx 2、MMP13及內(nèi)參(β-actin)均由深圳晶美生物科技公司設(shè)計(jì)合成。DPX型雙能X射線骨密度儀購(gòu)自Lunar公司；UH4150型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司；7600型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本ATACH公司；BX53型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；9700型聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 方法

1.2.1建模、分組與干預(yù)：將50只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表分為為5組：正常對(duì)照組、模型空白組、異補(bǔ)骨脂素低濃度組、異補(bǔ)骨脂素中濃度組、異補(bǔ)骨脂素高濃度組，每組10只。除正常對(duì)照組外，均采用維甲酸灌胃建立骨質(zhì)疏松癥大鼠模型：取維酸鉀和1 %羧甲基纖維素鈉，混合均勻并配置成終濃度為含7 %維酸鉀的混懸液，1 mL/100 g灌胃，每天1次，持續(xù)2周[5]。與此同時(shí)，正常對(duì)照組大鼠每天灌胃1 %羧甲基纖維素鈉+蒸餾水，共2 mL，每天1次。建模成功后，異補(bǔ)骨脂素低濃度組、異補(bǔ)骨脂素中濃度組、異補(bǔ)骨脂素高濃度組分別給予25、50、100 mg/kg異補(bǔ)骨脂素(溶于2 mL生理鹽水中)灌胃，正常對(duì)照組和模型空白組給予2 mL生理鹽水灌胃，每天1次，每周停用1 d，持續(xù)3個(gè)月。

1.2.2骨密度檢測(cè)：分別于治療前后采用雙能X射線骨密度儀檢測(cè)大鼠股骨近端、L4～6腰椎骨骨密度，取平均值。

1.2.3骨代謝檢測(cè)：分別于治療后取大鼠尾靜脈血3 mL檢測(cè)骨代謝指標(biāo)，其中血鈣、血磷分別采用MTB法、鉬酸法測(cè)得；BGP和NTX均采用ELISA法檢測(cè)。

1.2.4骨結(jié)構(gòu)變化檢測(cè)：治療后將實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭處死，取股骨干骺端組織1 mm3。常規(guī)脫鈣、切片、脫蠟、水化，給予蘇木精染色。以鹽酸酒精分化，以氨水返藍(lán)，持續(xù)5 s后以自來(lái)水沖洗1 min。伊紅染色，梯度濃度乙醇脫水，固定封片后鏡檢。

1.2.5骨組織Runx 2、MMP 13 mRNA檢測(cè)：取股骨干骺端組織常規(guī)提取總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，測(cè)定其濃度與純度。Runx 2上游引物：5’-ACTGATCGTTGCTAGCTAGGCT-3’，下游引物：5’-CTGACTGCTAGCTAGTTTGATC-3’；MMP13上游引物：5’-CTCGATCGATAAACTAGCTGGA-3’，下游引物：5’-CCGGATCGATGGTTCAGTAGTT-3’；β-actin上游引物：5’-TTAAACTAGCTAGTTTAGCTAA-3’，下游引物：5’-CTCTCGATCAGTCTAGTCATGG-3’。PCR反應(yīng)：94 ℃(5 min)→94 ℃(40 s)→51 ℃(40 s)→72 ℃(1 min)，35個(gè)循環(huán)，72 ℃(10 min)。分析目的基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.6骨組織Runx 2、MMP 13蛋白表達(dá)檢測(cè)：取股骨干骺端組織BCA蛋白定量，上樣。電泳分離并轉(zhuǎn)膜，洗膜后以脫脂牛奶封閉10 min。加入一抗，4 ℃過(guò)夜；洗脫后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，漂洗。染膜，暗室內(nèi)曝光，分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析(F檢驗(yàn))，每?jī)山M間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度的影響

建模和干預(yù)期間正常對(duì)照組、模型空白組、異補(bǔ)骨脂素低濃度組、異補(bǔ)骨脂素中濃度組、異補(bǔ)骨脂素高濃度組分別有1、3、2、2、1只死亡，多死于灌胃時(shí)不慎穿破食道，有2只大鼠死亡原因未明。治療前后采用雙能X線骨密度儀測(cè)量骨密度，正常對(duì)照組骨密度均無(wú)明顯變化(P<0.05)，余四組骨密度均下降(P<0.05)。治療后與正常對(duì)照組比較，其余四組骨密度均下降(P<0.05)；與模型空白組比較，異補(bǔ)骨脂素三個(gè)濃度組的骨密度均升高(P<0.05)，且呈濃度依賴。見(jiàn)表1。

表1 異補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度的影響Table 1 Effect on bone mineral density in rats with osteoporosis

2.2 異補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨代謝的影響

分別采用MTB法、鉬酸法、ELISA測(cè)定治療后各組大鼠的骨代謝。與正常對(duì)照組比較，模型空白組血鈣無(wú)明顯變化(P>0.05)，異補(bǔ)骨脂素三個(gè)濃度組的血鈣均升高(P<0.05)，且呈濃度依賴；各組血磷均相近(P>0.05)；與正常對(duì)照組比較，其余四組BGP均下降(P<0.05)，NTX均升高(P<0.05)；與模型空白組比較，異補(bǔ)骨脂素三個(gè)濃度組的BGP均升高(P<0.05)，NTX均下降(P<0.05)，且呈濃度依賴。見(jiàn)表2。

表2 異補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨代謝的影響Table 2 The effects on bone metabolism in rats with osteoporosis

2.3 異補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)HE染色觀察骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨結(jié)構(gòu)，正常對(duì)照組可見(jiàn)骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，髓腔相對(duì)小，且腔內(nèi)造血細(xì)胞豐富；模型空白組骨小梁數(shù)目顯著減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞數(shù)量顯著減少，脂肪細(xì)胞顯著增多；異補(bǔ)骨脂素低濃度組骨小梁數(shù)目明顯減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞明顯，骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞數(shù)量明顯減少，脂肪細(xì)胞明顯增多；異補(bǔ)骨脂素中濃度組骨小梁數(shù)目減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)遭破壞，骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞數(shù)量減少，脂肪細(xì)胞增多；異補(bǔ)骨脂素高濃度組骨小梁數(shù)目輕微減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)輕微受損，骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞數(shù)量輕微減少，可見(jiàn)少量脂肪細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 骨質(zhì)疏松大鼠骨結(jié)構(gòu)HE染色(×50)注：A：正常對(duì)照組；B：模型空白組；C：異補(bǔ)骨脂素低濃度組；D：異補(bǔ)骨脂素中濃度組；E：異補(bǔ)骨脂素高濃度組。Fig.1 HE staining of bone structure in osteoporotic rats (×50)

2.4 異補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP 13 mRNA表達(dá)的影響

采用qRT-PCR方法檢測(cè)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織Runx 2、MMP 13 mRNA表達(dá)。與正常對(duì)照組比較，其余四組Runx 2 mRNA表達(dá)水平均下降(P<0.05)，與模型空白組比較，異補(bǔ)骨脂素三個(gè)濃度組的Runx 2 mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05)，且呈濃度依賴；MMP13 mRNA變化趨勢(shì)正相反。見(jiàn)表3。

表3 異補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP 13 mRNA表達(dá)的影響Table 3 Effects on the expressions of Runx 2 and MMP 13 mRNA in bone tissues of osteoporotic rats

2.5 異補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP13 蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting方法檢測(cè)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP 13 蛋白表達(dá)。與正常對(duì)照組比較，其余四組Runx 2 蛋白表達(dá)水平均下降(P<0.05)；與模型空白組比較，異補(bǔ)骨脂素三個(gè)濃度組的Runx 2 蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)，且呈濃度依賴；MMP 13 蛋白表達(dá)趨勢(shì)正相反。見(jiàn)表4和圖2。

圖2 異補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx2、MMP13 蛋白表達(dá)的影響注：A：正常對(duì)照組；B：模型空白組；C：異補(bǔ)骨脂素低濃度組；D：異補(bǔ)骨脂素中濃度組；E：異補(bǔ)骨脂素高濃度組。Fig.2 Effects on the expressions of Runx2 and MMP13 proteins in bone tissues of osteoporotic rats

表4 異補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP13 蛋白表達(dá)的影響Table 4 Effects on the expressions of Runx 2 and MMP13 proteins in bone tissues of osteoporotic rats

3 討論

補(bǔ)骨脂中含有豐富的異補(bǔ)骨脂素，在既往的大鼠實(shí)驗(yàn)研究[6]中證實(shí)補(bǔ)骨脂注射液可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，抑制成骨細(xì)胞的凋亡。該藥物還可促進(jìn)體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與分化，并且還可促進(jìn)BGP的分泌，減少鈣鹽沉積，證實(shí)異補(bǔ)骨脂素是抗骨質(zhì)疏松的有效成分[7]。本次研究采用維甲酸與1 %羧甲基纖維素鈉混合灌胃建立骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，相較于常規(guī)去卵巢造模方法可減輕對(duì)大鼠造成的傷害，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利原則，與劉穎等[8]報(bào)道的造模方法一致。但有研究[9]認(rèn)為，該方法建模成功率不理想，可能是由于維酸鉀與1 %羧甲基纖維素鈉混合灌胃對(duì)骨吸收和骨形成的影響不顯著，作用緩慢。本研究發(fā)現(xiàn)治療后異補(bǔ)骨脂素三個(gè)濃度組的骨密度和骨代謝均顯著改善，作用效果呈濃度依賴性。

Runx 2是轉(zhuǎn)錄因子Runxx家族的重要成員之一，是一種特異性轉(zhuǎn)錄因子，可參與骨組織的形成和重建。Runx 2決定著多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，并且還可促進(jìn)軟骨的血管化，加快軟骨細(xì)胞的成熟，與破骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的形成也密切相關(guān)[10-11]。MMP13是靶向軟骨降解的主要酶，主要局限于結(jié)締組織，具有特異性切割I(lǐng)I型膠原作用，在骨骼發(fā)育和軟骨重建中均有參與[12]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)[13-14]，通過(guò)調(diào)控骨組織Runx 2/MMP13信號(hào)通路的基因與蛋白表達(dá)可促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，改善骨代謝和骨微結(jié)構(gòu)，是骨質(zhì)疏松癥臨床治療研究的新靶點(diǎn)。本研究推測(cè)異補(bǔ)骨脂素可對(duì)骨組織Runx 2/MMP13信號(hào)通路產(chǎn)生調(diào)控作用，對(duì)骨代謝的調(diào)控作用、骨結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用很可能均通過(guò)此途徑實(shí)現(xiàn)。

本研究中異補(bǔ)骨脂素三個(gè)濃度組的骨結(jié)構(gòu)破壞減輕，可見(jiàn)異補(bǔ)骨脂素可減輕骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨結(jié)構(gòu)破壞，且呈濃度依賴性。此外，異補(bǔ)骨脂素三個(gè)濃度組的骨組織Runx 2 mRNA及蛋白表達(dá)均高于模型空白組，MMP13 mRNA與蛋白表達(dá)均低于模型空白組，推測(cè)異補(bǔ)骨脂素可調(diào)控骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx 2/MMP13信號(hào)通路，促進(jìn)Runx 2基因及蛋白表達(dá)，抑制MMP13基因及蛋白表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)骨保護(hù)作用。Jian Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)異補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠模型療效理想，且發(fā)現(xiàn)該藥物可減輕其氧化應(yīng)激反應(yīng)；Ge L等[16]指出異補(bǔ)骨脂素可通過(guò)激活成骨細(xì)胞的生物學(xué)活性改善骨代謝，也證實(shí)該藥物在骨質(zhì)疏松癥治療方面有良好的應(yīng)用前景。

綜上所述，在骨質(zhì)疏松癥大鼠中采用異補(bǔ)骨脂素治療可提高大鼠的骨密度，改善骨代謝，并且可上調(diào)Runx 2 mRNA及蛋白表達(dá)、下調(diào)MMP13 mRNA及蛋白表達(dá)。