季樂財 張樂平 呂建文 李曉定 鄒小飛 樸瑋

耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)具有病情重、花費高、治愈率低等特點，是全球結(jié)核病防治的主要挑戰(zhàn)。2019年我國耐多藥/耐利福平結(jié)核病(MDR/RR-TB)報告例數(shù)為6.5萬，估算發(fā)病率為4.5/10萬[1]。因此，掌握MTB的分子流行病學(xué)特征和耐藥譜，對制定結(jié)核病防控策略具有重要指導(dǎo)意義。全基因組測序克服了傳統(tǒng)表型藥物敏感性試驗(簡稱“表型藥敏試驗”)及其他分子檢測的局限性，可以快速提供整個目的基因組的詳細(xì)序列信息，于2018年獲得了WHO[2]快速診斷耐藥結(jié)核病相關(guān)技術(shù)指南的權(quán)威支持。目前，全基因組測序在結(jié)核病領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用[3-5]，檢測MTB耐藥性也較成熟[6]。本研究以該技術(shù)為基礎(chǔ)，檢測深圳市MDR-MTB菌株對不同藥品的耐藥基因突變位點，特別是對利奈唑胺和貝達(dá)喹啉等抗結(jié)核新藥，以掌握本市MDR-MTB的耐藥譜，為相關(guān)患者的治療及防控提供科學(xué)依據(jù)。

材料和方法

一、研究資料

選取2013—2017年存儲于深圳市慢性病防治中心結(jié)核病實驗室所有的481株MDR-MTB菌株，排除7株被污染、5株丟失保種管的菌株。對469株有效菌株進(jìn)行復(fù)蘇，獲得420株復(fù)蘇成功菌株，復(fù)蘇成功率為89.55%(420/469)。提取復(fù)蘇后菌株的DNA，對其進(jìn)行基因測序。

二、 研究方法

1.菌株復(fù)蘇：將臨床分離株放入37 ℃培養(yǎng)箱中溶解，使用無菌滴管混勻菌液，吸取0.5 ml菌液轉(zhuǎn)移至羅氏培養(yǎng)基斜面上，每株臨床分離株培養(yǎng)2管，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周后檢查菌落生長情況。

2. DNA提取：用接種環(huán)收集生長的細(xì)菌并懸在約300 μl的去離子水中，混勻后于95 ℃滅活20 min，10 625×g離心5 min，所得上清液即為所需DNA。

3.基因測序：將提取的菌株DNA 送至深圳醫(yī)藥聯(lián)盟公司，在Illumina平臺上構(gòu)建文庫，并對其進(jìn)行測序。測序深度為100×，使用內(nèi)部Perl腳本分析原始數(shù)據(jù)，檢測MDR-MTB菌株對14種藥品(異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、鏈霉素、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、氟喹諾酮類、乙硫異煙胺、對氨基水楊酸、利奈唑胺、氯法齊明、貝達(dá)喹啉)的耐藥譜。其中一線抗結(jié)核藥品的耐藥預(yù)測基于2018年發(fā)表的耐藥突變和無害突變集[7]；而二線抗結(jié)核藥品的耐藥預(yù)測則根據(jù)Coll等[8]提供的耐藥突變。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用Epidata 3.0軟件建立數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行平行雙錄入，校對完成后導(dǎo)出為Excel表格并整理分析。采用頻數(shù)、構(gòu)成比(%)等進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計描述。應(yīng)用R(3.6.2版本)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析并繪制MDR-MTB菌株耐藥情況弦圖，GraphPad Prism 8.0軟件繪制準(zhǔn)廣泛耐藥MTB(pre-XDR-MTB)及廣泛耐藥MTB(XDR-MTB)菌株耐藥情況熱圖。

結(jié) 果

420株MDR-MTB臨床分離株原始全基因組測序數(shù)據(jù)采用內(nèi)部Perl腳本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示所有菌株對14種藥品均發(fā)生耐藥基因突變，除對異煙肼、利福平全部耐藥外，對鏈霉素的耐藥率最高，達(dá)67.86%；乙胺丁醇次之，為66.19%；對貝達(dá)喹啉、氯法齊明未見耐藥。共發(fā)現(xiàn)212種基因突變類型，以katG-315-S/T(81.43%)、rpoB-450-S/L(58.57%)、rpsL-43-K/R(65.96%)、embB-306-M/V(32.37%)突變居多(表1)。其中，XDR-MTB菌株占5.48%(23/420)，pre-XDR-MTB菌株占23.10%(97/420)，見圖1、2。

表1 420株MDR-MTB臨床分離株耐藥及基因突變類型構(gòu)成情況

EMB：乙胺丁醇，PZA：吡嗪酰胺，Sm：鏈霉素，F(xiàn)Qs：氟喹諾酮類，Am：阿米卡星，Cm：卷曲霉素，Km：卡那霉素，Eto：乙硫異煙胺，PAS：對氨基水楊酸， Lzd：利奈唑胺，Bdq：貝達(dá)喹啉，Cfz：氯法齊明。S：敏感，R：耐藥。數(shù)字代表每種藥品耐藥或敏感的株數(shù)，上半部分的不同顏色代表不同藥品，下半部分的紅色及綠色分別代表耐藥及敏感，耐藥株數(shù)匯入紅色，敏感株數(shù)匯入綠色，顏色的寬度代表數(shù)值的大小，共計12種藥品的5040個藥敏值圖1 420株MDR-MTB臨床分離株耐藥情況弦圖

數(shù)字代表菌株編號，R代表耐藥，S代表敏感圖2 120株pre-XDR-MTB及XDR-MTB臨床分離株耐藥情況熱圖

討 論

MTB的體外藥敏試驗對臨床治療及防治政策的制定意義重大。WHO[9]指南建議采用比例法進(jìn)行藥敏試驗，但該方法操作繁雜且需1個月以上的報告時間，也不便于追加藥品。而耐藥分子檢測技術(shù)主要基于熒光PCR法和分子雜交等技術(shù)，具有操作簡便、速度快、敏感度及特異度高等優(yōu)勢[10]，可基本解決MDR-TB的診斷問題，但也存在一定的局限性：一是隨著對MTB耐藥研究的深入，更多的耐藥相關(guān)突變不斷被發(fā)現(xiàn)，而相關(guān)試劑盒不能同步更新；二是診斷為MDR-TB后，仍無法獲得所有抗結(jié)核藥品的耐藥信息，不能及時給予患者個體化的最佳治療方案，或無法因藥物不良反應(yīng)而有效調(diào)整方案。

全基因組測序檢測耐藥具有高敏感度、高特異度、可重復(fù)分析數(shù)據(jù)，以及可依據(jù)研究進(jìn)展進(jìn)一步優(yōu)化分析的特點，目前其已成為MTB耐藥分析的重要方式，在歐洲已普遍應(yīng)用于耐藥結(jié)核病的檢測[11]。本研究參考的一線抗結(jié)核藥品耐藥突變數(shù)據(jù)庫是以10 290株臨床分離菌株的表型藥敏試驗結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，對異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺耐藥有著良好的預(yù)測效果(檢測敏感度分別達(dá)到97.1%、97.5%、94.6%和91.3%，特異度分別為99.0%、98.8%、93.6%和96.8%)，其不僅收錄了目前已知的所有耐藥突變[7]，還對耐藥基因上的敏感突變進(jìn)行了注釋，可以同時預(yù)測菌株對一線抗結(jié)核藥品的耐藥性和敏感性。采用的二線抗結(jié)核藥品耐藥數(shù)據(jù)庫則是整合了TBDreaMDB和MUBII-TB-DB中收錄的經(jīng)GeneXpert MTB/RIF、MTBDRplus、MTBDRsl檢測的耐藥突變，該數(shù)據(jù)庫以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測菌株對二線抗結(jié)核藥品耐藥性的準(zhǔn)確度都達(dá)到70%以上(除卷曲霉素外)，在國際上具有較高權(quán)威性[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，深圳市MDR-MTB臨床分離株中XDR-MTB占5.48%，低于世界平均水平(9.5%)[12]，但pre-XDR-MTB臨床分離株達(dá)到23.10%，提示深圳市難治性MDR-TB患者比例高，MDR-TB的治療及防控存在一定難度。WHO發(fā)布的最新耐藥結(jié)核病治療指南指出，MDR-TB治療方案中A組藥品包括氟喹諾酮類、利奈唑胺、貝達(dá)喹啉，B組包括氯法齊明、環(huán)絲氨酸、特立齊酮，建議采用3種A組藥品與至少1種B組藥品聯(lián)合作為長療程方案[13]。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，深圳市MDR-MTB臨床分離株對氟喹諾酮類藥品的耐藥率已接近30%，提示若直接采用WHO治療指南選用氟喹諾酮類藥品，可能會因為有效藥品<4種而出現(xiàn)較大比例的不完全有效治療，造成更嚴(yán)重耐藥。建議在治療前盡可能取得氟喹諾酮類藥品的藥敏試驗結(jié)果，以制定合理有效的治療方案。而利奈唑胺作為WHO新推薦的核心藥品，要求嚴(yán)格規(guī)范且謹(jǐn)慎使用，且需與≥3種其他有效藥品聯(lián)用，以防出現(xiàn)利奈唑胺耐藥。本研究雖僅發(fā)現(xiàn)1株利奈唑胺耐藥臨床分離株，但仍需警惕該藥品的合理規(guī)范使用；另外，由于利奈唑胺及貝達(dá)喹啉價格高昂，大部分低收入結(jié)核病患者在經(jīng)濟(jì)上難以承受，限制了該類藥品的應(yīng)用，對患者組成有效的治療方案存在較大困難。

另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)MDR-MTB臨床分離株對阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素等二線注射類抗結(jié)核藥品的耐藥率不高，分別為5.48%、6.67%、5.48%。但根據(jù)2018年WHO對具有完整治療結(jié)局的所有MDR-TB患者進(jìn)行的Meta分析結(jié)果顯示，應(yīng)用二線注射類抗結(jié)核藥品并不能使患者獲益，即使患者對這些藥品敏感也不主張使用，除非無法組成有效治療方案才可以嘗試使用[13]。這提示在組成MDR-TB有效治療方案困難的情況下，當(dāng)二線注射類抗結(jié)核藥品藥敏試驗結(jié)果提示敏感時，可考慮繼續(xù)使用二線注射類抗結(jié)核藥品，這也符合我國耐藥結(jié)核病治療指南[14]及專家共識[15]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，本市MDR-MTB臨床分離株對乙硫異煙胺、對氨基水楊酸的耐藥率較低，可用其作為重要組成藥品應(yīng)用于MDR-TB患者的治療。而乙胺丁醇、吡嗪酰胺、鏈霉素等一線抗結(jié)核藥品的耐藥程度非常嚴(yán)重，分別達(dá)到了66.19%、28.33%、67.86%，可能與初治患者不規(guī)范用藥有關(guān)，再次凸顯出結(jié)核病治療全程、規(guī)律、適量原則的重要性。

綜上，深圳市MDR-MTB臨床分離株中pre-XDR-MTB的比例較高，全基因組測序預(yù)測深圳市MDR-MTB臨床分離株對一線抗結(jié)核藥品及氟喹諾酮類藥品的耐藥率較高，臨床實踐中應(yīng)結(jié)合藥敏試驗結(jié)果謹(jǐn)慎使用；而預(yù)測其對乙硫異煙胺、氯法齊明、對氨基水楊酸等二線注射類抗結(jié)核藥品的耐藥率較低，考慮這些藥品可作為MDR-TB患者治療方案的組成部分。本次研究結(jié)果提示，臨床工作中應(yīng)盡快獲取MDR-TB患者耐藥譜以制定個體化治療方案，必要時加用二線注射類抗結(jié)核藥品或新藥，以提高患者治愈率。

值得注意的是，本研究也存在一定的局限性。一是菌株復(fù)蘇后的活性下降可能會影響全基因組測序結(jié)果；二是由于經(jīng)濟(jì)因素，本研究僅送檢全基因組測序，未與表型藥敏試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，而是采用與國際權(quán)威數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，可能導(dǎo)致結(jié)果有偏倚；三是限于菌株儲存條件，本院存儲的MDR-MTB菌株大部分為抗結(jié)核藥品治療前的菌株，未能監(jiān)測其在治療過程中的變化情況。