郭倩 申晨 申阿東

結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)致病菌，由其感染所引起的人類結(jié)核病被稱為是全球頭號(hào)傳染病殺手。長(zhǎng)久以來(lái)，巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等吞噬細(xì)胞被認(rèn)為是結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的主要宿主細(xì)胞[1]，經(jīng)由呼吸道等入侵的結(jié)核分枝桿菌可通過(guò)多種配體-受體途徑被宿主吞噬細(xì)胞識(shí)別和吞入[2-3]，通過(guò)吞噬細(xì)胞的固有殺傷能力和隨后啟動(dòng)T淋巴細(xì)胞免疫為主的獲得性免疫反應(yīng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行殺傷和清除。目前的研究表明，結(jié)核分枝桿菌不僅能夠在吞噬細(xì)胞內(nèi)存活，還能夠感染以宿主造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞為代表的干細(xì)胞，并在其中潛伏和增殖[4-6]。

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制和自我更新能力的多潛能細(xì)胞，其通常被描述為位于不可逆細(xì)胞分化等級(jí)最高的離散細(xì)胞群，可以通過(guò)特定細(xì)胞表面標(biāo)記物對(duì)其進(jìn)行區(qū)分和分類。根據(jù)發(fā)生學(xué)來(lái)源可分為胚胎干細(xì)胞和造血干細(xì)胞，根據(jù)可以分化產(chǎn)生細(xì)胞類型的數(shù)量，可分為單能、多能和全能干細(xì)胞。造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞屬于多能干細(xì)胞。

干細(xì)胞具有自我更新、產(chǎn)生低水平活性氧、表達(dá)藥物外排泵等能力[7-8]，有助于結(jié)核分枝桿菌發(fā)生藥物逃避和持久生存；同時(shí)，其可以高度遷移/穿梭于骨髓、循環(huán)血和結(jié)核肉芽腫之間[9-10]，有助于結(jié)核分枝桿菌發(fā)生血源性播散。因此，干細(xì)胞對(duì)于維持結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)的休眠和傳播具有十分重要的意義[11]。

一、結(jié)核分枝桿菌持久感染損傷造血干細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)錄

造血干細(xì)胞是血液系統(tǒng)中一類具有造血功能的異質(zhì)性成體干細(xì)胞，其差異表達(dá)白細(xì)胞分化抗原簇(cluster of differentiation, CD) 45和CD34等表面分子。正常情況下，大部分造血干細(xì)胞在骨髓中處于靜止?fàn)顟B(tài)，僅有一小部分為造血提供需要。但當(dāng)出現(xiàn)失血、感染等應(yīng)激情況時(shí)，造血干細(xì)胞會(huì)被迅速激活，在骨髓中增殖并隨后進(jìn)入外周血。造血干細(xì)胞在胸腺激素的誘導(dǎo)下可分化成具有免疫活性的T淋巴細(xì)胞，活化的T細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌感染個(gè)體的抗結(jié)核細(xì)胞免疫應(yīng)答中具有重要作用。骨髓外T細(xì)胞可通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-2、γ-干擾素等)以確保造血干細(xì)胞分化血細(xì)胞的平衡輸出和自我更新的終生維持[12-13]。

結(jié)核分枝桿菌可能直接感染造血干細(xì)胞并在其內(nèi)潛伏或增殖。有研究人員發(fā)現(xiàn)，異基因造血干細(xì)胞移植后的個(gè)體患活動(dòng)性結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)是普通人的2～40倍[14]，其原因一方面可能是移植前受體體內(nèi)休眠的結(jié)核分枝桿菌在移植后由于免疫功能處于抑制狀態(tài)而被激活，另一方面也提示一些移植供者的造血干細(xì)胞可能攜帶結(jié)核分枝桿菌[15]。Tornack 等[6]在小鼠淋巴細(xì)胞活化信號(hào)分子相關(guān)受體家族(SLAM)CD150+的造血干細(xì)胞亞群中找到了結(jié)核分枝桿菌感染造血干細(xì)胞的直接證據(jù)——上述細(xì)胞內(nèi)均能夠檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌的核酸。由于上述細(xì)胞中的結(jié)核分枝桿菌能夠表達(dá)休眠生存調(diào)節(jié)子(dormancy survival regulon，DosR)和熱休克蛋白X(HspX)等休眠相關(guān)基因，提示結(jié)核分枝桿菌感染造血干細(xì)胞并在其內(nèi)休眠。在結(jié)核分枝桿菌侵入宿主細(xì)胞后，長(zhǎng)期持久抗原刺激可誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子[16]，其中γ-干擾素和白細(xì)胞介素-2表達(dá)水平的平衡被認(rèn)為在維持造血干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用[17]。Li等[18]構(gòu)建小鼠感染模型，用結(jié)核分枝桿菌毒力蛋白——早期分泌抗原靶6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)構(gòu)建的融合蛋白對(duì)小鼠分別進(jìn)行瞬時(shí)灌注刺激(對(duì)照組)和持續(xù)灌注刺激(實(shí)驗(yàn)組)。12周后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的γ-干擾素濃度高于對(duì)照組，白細(xì)胞介素-2濃度低于對(duì)照組，γ-干擾素濃度的持續(xù)增高降低了細(xì)胞譜系分化抗原 (-)和Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族蛋白c-Kit(+)造血干細(xì)胞/造血祖細(xì)胞的增殖活性，損害造血干細(xì)胞的增殖和自我更新，繼而導(dǎo)致造血干細(xì)胞耗竭[18-19]。此外，γ-干擾素的高水平表達(dá)還會(huì)通過(guò)上調(diào)堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子Batf2[20]和干擾素調(diào)節(jié)因子IRF8[21]的表達(dá)，誘導(dǎo)造血干細(xì)胞及造血祖細(xì)胞向髓系細(xì)胞分化[21]；而補(bǔ)充白細(xì)胞介素-2可通過(guò)激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和下調(diào)γ-干擾素恢復(fù)造血祖細(xì)胞的增殖活性，維持造血干細(xì)胞正常造血[17-18]。

二、結(jié)核分枝桿菌感染減弱了間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種來(lái)源于發(fā)育早期中胚層的非造血干細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)功能，可通過(guò)細(xì)胞間的相互作用及分泌細(xì)胞因子來(lái)抑制T細(xì)胞的增殖及介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。而可與之相混淆的另一概念“間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞”被認(rèn)為主要具有顯著的分泌、免疫調(diào)節(jié)等功能[22]；盡管間充質(zhì)干細(xì)胞和間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞早在50多年前就已被發(fā)現(xiàn)，且國(guó)際細(xì)胞和基因治療學(xué)會(huì)及間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞委員會(huì)也明確闡述了兩者的區(qū)別和不可互換性[23]，并分別以英文字母縮寫MSCs和MSC指代，但是有研究對(duì)這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)沒(méi)有進(jìn)行明確的區(qū)分，間充質(zhì)干細(xì)胞也被指代間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，例如，Saalbach和Anderegg[24]探討間充質(zhì)細(xì)胞多分化能力時(shí)，其描述與間充質(zhì)干細(xì)胞的概念相一致。因此，筆者在文中所述間充質(zhì)干細(xì)胞不除外間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。

Beamer等[4]和Das等[11]猜測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能是休眠期結(jié)核分枝桿菌長(zhǎng)期存活的宿主細(xì)胞之一且參與結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制，繼而通過(guò)用綠色熒光蛋白熒光標(biāo)記結(jié)核分枝桿菌的方法對(duì)這一猜測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌可在體外感染間充質(zhì)干細(xì)胞，其中低親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR/CD271, 腫瘤壞死因子受體超家族成員)陽(yáng)性的間充質(zhì)干細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌最容易感染的間充質(zhì)干細(xì)胞類型。此外，研究也表明，在異煙肼和利福平抗結(jié)核治療過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)小鼠肺和脾中的結(jié)核分枝桿菌含量快速減少，但仍有少量的結(jié)核分枝桿菌可在間充質(zhì)干細(xì)胞中持久存活，這表明結(jié)核分枝桿菌感染的間充質(zhì)干細(xì)胞為結(jié)核分枝桿菌持久存活提供了一個(gè)相對(duì)適宜的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，而且被感染的間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)處于休眠期的結(jié)核分枝桿菌仍然具有再感染健康組織的能力[4]。

由于γ-干擾素和α-干擾素等炎性細(xì)胞因子在結(jié)核分枝桿菌感染后增高[25]，巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的生存壓力較大；而間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新、相對(duì)靜止及只產(chǎn)生低水平內(nèi)源性活性氧等多種特性，其為結(jié)核分枝桿菌的潛伏提供了有利條件。一方面，結(jié)核分枝桿菌減弱間充質(zhì)干細(xì)胞的自噬和一氧化氮介導(dǎo)的殺傷作用; 另一方面，脂質(zhì)介質(zhì)前列腺素E2有助于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出親細(xì)菌的特性[10]，而結(jié)核分枝桿菌具有富含脂質(zhì)的細(xì)胞壁且能通過(guò)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞中脂質(zhì)合成并留在脂質(zhì)體內(nèi)以逃避宿主適應(yīng)性免疫反應(yīng)[11]。此外，結(jié)核分枝桿菌還可通過(guò)上調(diào)自身DosR等休眠相關(guān)基因的持續(xù)表達(dá)進(jìn)入休眠狀態(tài)，休眠的結(jié)核分枝桿菌對(duì)常規(guī)抗結(jié)核藥品反應(yīng)差，通常僅可通過(guò)誘導(dǎo)自噬消除[26]。間充質(zhì)干細(xì)胞也可被招募至肉芽腫周圍[10]，被結(jié)核分枝桿菌感染的間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)自噬和一氧化氮介導(dǎo)的殺傷作用來(lái)限制結(jié)核分枝桿菌的存活[27]。而與駐留在巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌不同，間充質(zhì)干細(xì)胞中的結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥品的耐受性非常好，這可能和缺氧、低水平一氧化氮、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)較高和空泡型H+ATP酶表達(dá)低[10]等有關(guān)。因此，或許可以通過(guò)增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的自噬能力或采用體外擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞輔助治療，從而將患者機(jī)體內(nèi)的慢性炎癥轉(zhuǎn)化為有益的免疫反應(yīng)，改善其臨床預(yù)后。

三、干細(xì)胞在結(jié)核病預(yù)防及免疫治療中的應(yīng)用

(一)造血干細(xì)胞在結(jié)核病免疫治療中的應(yīng)用

1.造血干細(xì)胞表面蛋白可用于開發(fā)新疫苗：卡介苗是一種能夠增強(qiáng)免疫、預(yù)防結(jié)核病最直接也唯一被認(rèn)可的方法，卡介苗接種后進(jìn)入骨髓，改變了造血干細(xì)胞和多能祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄微環(huán)境[21]，并誘導(dǎo)分化產(chǎn)生針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的記憶T細(xì)胞，對(duì)預(yù)防結(jié)核病尤其是嬰幼兒期播散性結(jié)核病具有重要作用[28]。目前，卡介苗發(fā)揮免疫防御作用的機(jī)制并不完全清楚。Kaufmann等[21]通過(guò)構(gòu)建小鼠模型，發(fā)現(xiàn)卡介苗可使細(xì)胞譜系分化抗原陰性且Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族蛋白c-Kit和淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合體A雙陽(yáng)性細(xì)胞(LKS+細(xì)胞)增殖相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)CD150-且Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族蛋白c-Kit和淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合體A雙陽(yáng)性細(xì)胞(LKS+細(xì)胞)及CD48+的多能祖細(xì)胞向髓系分化，從而間接調(diào)控造血干細(xì)胞向造血祖細(xì)胞及造血祖細(xì)胞向單核細(xì)胞的分化，即卡介苗能夠提高巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的固有免疫、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性以及T淋巴細(xì)胞的活化，這些細(xì)胞可提供比初始單核/巨噬細(xì)胞更有力的抗結(jié)核防御作用，具有較強(qiáng)的殺菌能力，并且這種具有強(qiáng)殺菌能力的單核/巨噬細(xì)胞在體內(nèi)具有一定持久性，提示識(shí)別造血干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白可作為開發(fā)抗結(jié)核和其他傳染病疫苗的一種新策略。

2.造血干細(xì)胞基因修飾預(yù)防結(jié)核分枝桿菌感染：Hetzel 等[29]研發(fā)了一種造血干細(xì)胞基因治療方法，使用特異性表達(dá)γ-干擾素受體1基因(Ifngr1)的慢病毒載體，在卡介苗感染前將基因矯正的造血干細(xì)胞移植到Ifngr1缺失的小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接受移植的小鼠巨噬細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)Ifngr1，還可預(yù)防嚴(yán)重卡介苗病，并恢復(fù)肺和脾巨噬細(xì)胞的抗分枝桿菌活性，保護(hù)小鼠免受嚴(yán)重的結(jié)核分枝桿菌感染，是一種基于造血干細(xì)胞免疫基因修飾預(yù)防感染的策略。

(二)間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)免疫調(diào)節(jié)限制結(jié)核分枝桿菌感染

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種新型免疫細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)和抗菌等功能，可通過(guò)自噬、分泌自由基、表達(dá)清道夫受體和甘露醇受體來(lái)限制結(jié)核分枝桿菌的存活[27]。雷帕霉素可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞自噬，增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的吞噬殺傷作用[30]。間充質(zhì)干細(xì)胞還可以通過(guò)釋放活性氧和NO來(lái)抑制胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的活性[27]。

此外，間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外誘導(dǎo)增殖，采用體外擴(kuò)增的自體間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行移植治療，可將體內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)化為有益的免疫反應(yīng)。Choi等[31]采用膿腫分枝桿菌模擬結(jié)核分枝桿菌感染小鼠建模，將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組并分別注射體外擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞和磷酸鹽平衡液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射間充質(zhì)干細(xì)胞小鼠的荷菌量較少且存活時(shí)間>15 d的概率較大，且注射劑量越大存活率越高。另一項(xiàng)研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)膀胱結(jié)核有一定輔助治療作用[32]；耐藥和多耐藥結(jié)核病患者在接受自體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞治療后，胸部X線攝影檢查結(jié)果和患者病情得到顯著改善[33]。Skrahin等[34]在一項(xiàng)研究中指出，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輔助治療與臨床不良事件及急性毒性反應(yīng)無(wú)明顯關(guān)系，僅可能出現(xiàn)暫時(shí)性發(fā)熱,其對(duì)結(jié)核病患者似乎是安全的。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞有望成為限制結(jié)核分枝桿菌感染和結(jié)核病病情發(fā)展的潛在治療靶點(diǎn)。

(三)胚胎干細(xì)胞與抗結(jié)核新藥研發(fā)

胚胎干細(xì)胞在體外特定培養(yǎng)條件下可分化為與經(jīng)典巨噬細(xì)胞相似的巨噬樣細(xì)胞；該巨噬樣細(xì)胞不僅轉(zhuǎn)錄組學(xué)和免疫學(xué)特征與經(jīng)典巨噬細(xì)胞相似、能夠分泌炎性因子(如NO、α-干擾素等)，還能夠抑制甚至殺死結(jié)核分枝桿菌。Han等[35]通過(guò)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化增殖為巨噬樣細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上篩選出了一種被稱為“10-DEBC”的新型抗結(jié)核分枝桿菌藥物，為阻礙結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展奠定基礎(chǔ)。因此，干細(xì)胞不僅有可能作為結(jié)核病的新型免疫治療藥物，也可以為結(jié)核病的新藥研發(fā)提供篩選模型。

四、總結(jié)

作為一類新型免疫細(xì)胞，干細(xì)胞既能夠成為結(jié)核分枝桿菌的潛伏存活場(chǎng)所又具有一定的限制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的能力。盡管研究表明，干細(xì)胞可作為免疫靶點(diǎn)或免疫治療制劑用于調(diào)節(jié)與結(jié)核病相關(guān)的感染和炎癥，也可能為結(jié)核病的新藥或疫苗研發(fā)提供篩選模型。但是，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于干細(xì)胞與結(jié)核病的研究尚處于起步階段，在將干細(xì)胞應(yīng)用到結(jié)核病的臨床防治前，仍需要進(jìn)行大量的科學(xué)研究和臨床試驗(yàn)來(lái)探索其有效性及安全性。