王秀軍 劉秋月 陳曉鳳 于磊 馬艷 韓芬

結(jié)核病是全世界關(guān)注的影響人類公共健康的問題之一，2019年，全球新發(fā)肺結(jié)核患者1100萬例，結(jié)核病防治形勢仍然十分嚴(yán)峻[1]。結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后可逃避免疫系統(tǒng)的殺傷，其涉及的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。雖然目前對于結(jié)核病發(fā)生機(jī)制的研究取得了一定進(jìn)展，如Zhang等[2]發(fā)現(xiàn)Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β信號通路與肺結(jié)核發(fā)病相關(guān)； Zetter等[3]發(fā)現(xiàn)血管加壓素參與肺結(jié)核的發(fā)生及發(fā)展。但是上述研究結(jié)果用于闡釋肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制，仍有許多重要問題目前未能解決。

與基因表達(dá)相比，蛋白表達(dá)的變化，尤其是血漿蛋白表達(dá)的變化，對于早期發(fā)現(xiàn)和診斷損傷性病理、生理過程，判斷轉(zhuǎn)歸，評估預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療等方面，具有更為重要的意義。隨著當(dāng)今分子技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的興起，為尋找疾病生物標(biāo)志物提供了新的契機(jī)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究能提供更多的生命信息，可在更深入、更貼近生命本質(zhì)層次去發(fā)現(xiàn)和理解生命活動規(guī)律，以及生理、病理現(xiàn)象的本質(zhì)。作為一種發(fā)現(xiàn)的工具，蛋白質(zhì)組學(xué)通過比較不同情況下細(xì)胞、體液或組織中蛋白在表達(dá)數(shù)量、位置上的差異，探尋疾病相關(guān)的特異蛋白，從而為疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供線索，為疾病診斷提供分子標(biāo)識，為治療和藥物開發(fā)提供靶標(biāo)[4-5]。因此，疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究有著不可替代的臨床意義及應(yīng)用前景。

本研究分別以健康人和繼發(fā)性肺結(jié)核患者作為對照，應(yīng)用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對繼發(fā)性肺結(jié)核患者的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行檢測和篩選，分析和探討其特征與功能，確定繼發(fā)性肺結(jié)核患者的候選差異蛋白。

對象和方法

一、研究對象

納入首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院2019年3—12月確診的繼發(fā)性肺結(jié)核患者(結(jié)核組)共30例。正常對照者(對照組)來自同期北京市疾病預(yù)防控制中心健康查體者，共30名。知情同意協(xié)議和研究程序獲得倫理委員會的批準(zhǔn)，并且凡是同意參與這項(xiàng)研究的所有患者及健康志愿者均簽署了知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)核組。按照《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[6]標(biāo)準(zhǔn)診斷為繼發(fā)性肺結(jié)核；痰分枝桿菌抗酸染色陽性并菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌；年齡≥18歲；初治患者，未行抗結(jié)核藥品治療。(2)對照組。通過詢問病史和體格檢查證實(shí)無心、肝、腎、消化道、神經(jīng)系統(tǒng)等病史；年齡≥18歲；胸部影像學(xué)檢查正常，無活動性肺結(jié)核臨床癥狀，無其他慢性疾病；結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)陰性。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<18歲；(2)惡性腫瘤、糖尿病患者；(3)免疫系統(tǒng)疾病或接受免疫治療者；(4)人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染者；(5)處于妊娠期或哺乳期，并且有并發(fā)癥者。

二、儀器及主要試劑

液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜儀，型號為microQ-TofⅡ(Bruker，德國)；納升分析柱 dionex C18納升分離柱(內(nèi)徑75 μm，長15 cm，粒徑3 μm，孔徑100 μm)(戴安，美國)；捕獲柱dionex C18(內(nèi)徑300 μm，長5 mm，粒徑5 μm，孔徑100 μm)(戴安，美國)；半干槽(Bio-rad，美國)；MultiSkan3酶標(biāo)儀(Thermo，美國)；Qubit熒光蛋白定量試劑盒(Invitrogen，美國)；牛血清白蛋白(BSA)(Amresco，美國；貨號：0332)；苯甲基磺酰氟 (PMSF)(Amresco，美國；貨號：0754)。

三、血漿標(biāo)本收集

使用肝素抗凝的真空采血管收集新鮮血液10 ml，離心半徑19.5 cm，2000 r/min，4 ℃離心10 min，獲得的血漿被立即分裝同時(shí)凍存于-80 ℃冰箱待用，整個(gè)過程在6 h之內(nèi)完成，所有標(biāo)本沒有經(jīng)過反復(fù)凍融。

四、蛋白質(zhì)的裂解、定量和酶解

每組30份標(biāo)本，每10份標(biāo)本按照隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行隨機(jī)合并為生物學(xué)重復(fù)，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。去除血漿中高豐度蛋白，低豐度蛋白濃縮凍干，凍干后復(fù)溶于8 mol/L緩沖液[8 mol/L尿素；150 mmol/L、pH 值為8.0的三(羥甲基)氨基甲烷 TrisHCl]中，測定濃度。每組標(biāo)本加入胞內(nèi)蛋白酶賴氨酸-C(Lys-C)作用3 h加入NH4HCO3。稀釋尿素至濃度1.5 mmol/L左右，加入胰蛋白酶，37 ℃孵育20 h。

五、酶解產(chǎn)物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析

取酶解產(chǎn)物，按照定量結(jié)果取5 μg進(jìn)行LC-MS/MS分析。采用納升流速高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng) EASY-nLC1000進(jìn)行分離。酶解產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分離后用 Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長為180 min；檢測方式：正離子，母離子掃描范圍為300～1800 質(zhì)荷比(m/z)。

六、非標(biāo)記(label-free)分析

原始數(shù)據(jù)分析軟件為DataAnalysis 4.1(德國Bruker公司)，用于產(chǎn)生檢索用的mgf文件和提取一級質(zhì)譜定量信息；定量軟件為ProfileAnalysis 2.0，檢索和數(shù)據(jù)整合軟件ProteinScape 2.1(德國Bruker公司)；檢索引擎為Mascot 2.1(本地主機(jī))。

七、生物信息學(xué)分析

對獲得的差異蛋白利用基因本體論(gene onology，GO)(http:www.geneontology.org/)對差異蛋白進(jìn)行GO注釋。利用京都基因與基因組百科全書(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG)(http://www.genome.jp/kegg/)對差異蛋白進(jìn)行代謝通路分析。研究鑒定的差異蛋白的亞細(xì)胞定位情況、發(fā)揮的生物學(xué)功能和參與的細(xì)胞進(jìn)程。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、結(jié)核組及對照組一般情況比較

結(jié)核組與對照組比較，結(jié)核組平均年齡為(51.33±16.66)歲，對照組平均年齡為(47.67±15.32)歲，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.661，P=0.511)。結(jié)核組與對照組性別比(男/女)均為20/10；兩組均無糖尿病患者。結(jié)核組吸煙者占33.33%(10/30)，對照組吸煙者占13.33%(4/30)，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.320，P=0.127)。體質(zhì)量指數(shù)(BMI)結(jié)核組為21.12±2.76，對照組為22.34±3.65，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.460，P=0.150)。因此，兩組具有可比性，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

二、結(jié)核組血漿差異蛋白的鑒定

共檢測出1532個(gè)蛋白，利用ProfileAnalysis 2.0軟件，按照上述差異蛋白判斷標(biāo)準(zhǔn)確定結(jié)核組有518個(gè)差異蛋白，通過維恩分析，顯示其中高表達(dá)的差異蛋白有256個(gè)，低表達(dá)的差異蛋白有262個(gè)。

三、GO分析

利用PANTHER分析軟件，對以上差異表達(dá)蛋白的分子功能(molecular function)、生物過程(biological process)和細(xì)胞定位(cellular component)進(jìn)行詳細(xì)分析。分子功能分析結(jié)果如表1所示。差異蛋白的分子功能主要集中在結(jié)合[binding，29.79%(406/1363)]和蛋白質(zhì)結(jié)合[protein binding，24.80% (338/1363) ]，其他分子功能還涉及核酸結(jié)合[nucleic acid binding，9.32% (127/1363)]、轉(zhuǎn)移酶活性[transferase activity，5.36% (73/1363)]等。GO分類中的蛋白參與生物學(xué)過程分析結(jié)果：差異蛋白主要參與細(xì)胞過程[cellular process，14.75% (467/3167)]和代謝過程[metabolic process，11.11% (352/3167)]，生物過程調(diào)控[regulation of biological process，10.61% (336/3167)]、刺激反應(yīng)[response to stimulus，7.42% (235/3167)]，見表2。通過對差異蛋白的細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)大部分蛋白定位在細(xì)胞內(nèi)[intracellular，22.07% (389/1763)]、細(xì)胞[cell，22.01% (388/1763)]、細(xì)胞質(zhì)[cytoplasm，16.90% (298/1763)]、膜[membrane，12.31% (217/1763)]，見表3。

表1 差異蛋白的分子功能分析

續(xù)表1

表2 差異蛋白的生物進(jìn)程分析

表3 差異蛋白的細(xì)胞定位分析

四、KEGG分析

KEGG分析鑒定差異蛋白所覆蓋到的KEGG代謝通路信息(http://www genome. jp/kegg/pathway. html)。對得到的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共篩選到18個(gè)有差異的通路，其中17個(gè)為上調(diào)通路，1個(gè)為下調(diào)通路。有差異通路包括上調(diào)的背腹軸形成通路(dorso-ventral axis formation)，黏著斑通路(focal adhesion)，癌癥蛋白多糖通路(proteoglycans in cancer)，血小板活化通路(platelet activation)等及下調(diào)的肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)通路(regulation of actin cytoskeleton)等。如表4所示。

表4 肺結(jié)核相關(guān)差異蛋白上調(diào)與下調(diào)的KEGG分析

續(xù)表4

討 論

蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動態(tài)變化規(guī)律的科學(xué)，近年來廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。采用大規(guī)模、高通量、高敏感度的技術(shù)手段，通過全局性研究基因組所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)在不同時(shí)間與空間的表達(dá)譜和功能譜，全景式地揭示生命活動的本質(zhì)[7-8]。非標(biāo)記定量對不同狀態(tài)下的標(biāo)本單獨(dú)進(jìn)行質(zhì)譜分析，無需昂貴的核素標(biāo)簽做內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)低，對標(biāo)本的操作也最少，從而使其最接近原始狀態(tài)，并且不受標(biāo)本條件的限制，克服了標(biāo)記定量技術(shù)在對多個(gè)標(biāo)本進(jìn)行定量方面的缺陷。另外，克服了上述穩(wěn)定核素標(biāo)記定量的技術(shù)局限，通過大量譜圖記錄和比較，提供了大量相對蛋白豐度的差別信息，因此蛋白質(zhì)組學(xué)的非標(biāo)記技術(shù)逐漸成為研究的主要方向[9]。

繼發(fā)性肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，肺結(jié)核主要通過呼吸道傳播結(jié)核分枝桿菌而發(fā)病，其發(fā)病機(jī)制不但與機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量、毒力有關(guān)，還與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)。發(fā)病機(jī)制中細(xì)胞免疫反應(yīng)占主要地位，由多種細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、補(bǔ)體等參與，為通過T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)、巨噬細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的免疫反應(yīng)。繼發(fā)性肺結(jié)核是肺結(jié)核中一個(gè)主要類型，包括浸潤性、纖維空洞及干酪性肺炎等。因其對肺組織結(jié)構(gòu)造成干酪樣壞死、空洞形成、纖維增生等病理損傷，成為導(dǎo)致呼吸功能障礙的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[10-11]。為此，本研究運(yùn)用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找特異性的蛋白標(biāo)志物，為繼發(fā)性肺結(jié)核發(fā)生機(jī)制的探討、預(yù)測和預(yù)后的蛋白標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)核組與對照組患者比較存在著518個(gè)差異蛋白，提示這些差異蛋白可能與結(jié)核分枝桿菌感染并在肺內(nèi)形成病變有關(guān)。換言之，結(jié)核分枝桿菌侵入體內(nèi)所形成的感染過程及其所導(dǎo)致的免疫反應(yīng)涉及蛋白質(zhì)組學(xué)的變化或異常，而結(jié)核分枝桿菌在肺組織的生長、繁殖及其引起的病理損傷也可導(dǎo)致這些差異蛋白的產(chǎn)生增加或消耗，從而使得差異蛋白不同于健康人的異常表達(dá)。

筆者從生物過程、分子功能、細(xì)胞組分等3個(gè)層面對這些差異蛋白進(jìn)行GO注釋和信號通路的分析。(1)血漿差異蛋白的細(xì)胞定位：本研究通過對血漿差異蛋白的細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要分布在細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)是各種細(xì)胞器發(fā)揮作用的場所。細(xì)胞器是細(xì)胞中通過生物膜與細(xì)胞中其他部分分隔開來的、功能上獨(dú)立的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可以合成蛋白并參與多項(xiàng)細(xì)胞功能。(2)血漿差異蛋白的分子功能：生物學(xué)過程是由分子功能有序地組成的。本研究按照分子功能對差異蛋白進(jìn)行歸類分析，發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要功能集中在結(jié)合和蛋白結(jié)合，提示這些差異蛋白主要與其他蛋白分子結(jié)合后發(fā)揮作用，并且具有較高的催化活性。(3)血漿差異蛋白參與的生物學(xué)過程：本研究顯示血漿差異蛋白參與多種生物學(xué)過程，但主要參與細(xì)胞進(jìn)程及代謝過程。推測差異蛋白所參與的這些生物學(xué)過程可能在繼發(fā)性肺結(jié)核發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了較為重要的作用。

本研究對血漿差異蛋白信號通路分析結(jié)果顯示，這些差異蛋白主要參與的信號通路包括上調(diào)的背腹軸形成通路、黏著斑通路、癌癥蛋白多糖通路及下調(diào)的肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)通路等。這些信號通路主要與細(xì)胞存活、增殖、動力、軸突吸引排斥等相關(guān)。其中，筆者發(fā)現(xiàn)差異蛋白最為富集的信號通路是背腹軸形成及黏著斑通路，這些通路是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的主要連接方式，參與細(xì)胞運(yùn)動與信號傳導(dǎo)，有利于維持細(xì)胞在運(yùn)動過程中的張力及細(xì)胞生存的信號傳遞，在誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、黏附、遷移、抗凋亡、纖維化、分化方面都起到了一定的作用，并在氧化應(yīng)激時(shí)調(diào)控細(xì)胞功能[12-13]，提示這些差異蛋白至少可能通過黏著斑反應(yīng)通路，在繼發(fā)性肺結(jié)核感染進(jìn)展加重的過程中發(fā)揮了重要作用。

繼發(fā)性肺結(jié)核患者存在著數(shù)百種血漿差異蛋白，其通過多種代謝通路、參與多種生物學(xué)過程發(fā)揮多種分子功能。但因其數(shù)量巨大，無法全部用于臨床診治。因此，下一步筆者將會根據(jù)血漿差異蛋白的差異倍數(shù)與結(jié)核病和免疫反應(yīng)等的相關(guān)性，以及選擇適宜的商業(yè)化試劑盒進(jìn)一步驗(yàn)證候選的血漿差異蛋白，以期發(fā)現(xiàn)特異性的繼發(fā)性肺結(jié)核相關(guān)蛋白標(biāo)志物。