李永召

腦出血是指非外傷腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂所引發(fā)的出血，是神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域內(nèi)常見(jiàn)的疾病之一，具有較高的發(fā)病率和致死率[1,2]。腦出血后，出血灶周?chē)M織缺血、缺氧，造成炎性因子和多種因子大量釋放，腦水腫、氧化應(yīng)激等連鎖反應(yīng)引起腦組織繼發(fā)性損害，使腦出血患者的神經(jīng)細(xì)胞功能?chē)?yán)重受損[3,4]。有研究表明，腦出血后受損的神經(jīng)元軸突有一定的再生與修復(fù)能力[5]，此研究對(duì)臨床中腦出血患者神經(jīng)功能的恢復(fù)提供了新的治療靶點(diǎn)[6]。大蒜素是從蔥科蔥屬植物大蒜中提取的一種有機(jī)硫化合物，臨床上用于深部真菌和細(xì)菌感染及隱球菌性腦膜炎和肺結(jié)核的治療[7]，大蒜素同時(shí)具有消炎[8]、降血脂、降血壓、降血糖[9]及抗心律失常的藥理作用。大蒜素能改善腦缺血再灌注損傷，但有關(guān)大蒜素對(duì)腦出血損傷的研究筆者所見(jiàn)尚不多。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)膠原酶法制備腦出血大鼠模型，觀察大蒜素對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能的作用，并探討其促進(jìn)腦出血后軸突再生的影響，從而為大蒜素的臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性SD大鼠60只，SPF級(jí)，體重180～200 g，年齡6～8周，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0011。

1.1.2 藥物與試劑:大蒜素(西安天瑞生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：201933282)；大鼠神經(jīng)絲蛋白200(NF200)小鼠單克隆抗體(Merck公司，批號(hào)：N5389)、微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)兔多克隆抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab32454)、髓鞘堿性蛋白(MBP)兔多克隆抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab40390)、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP43)兔多克隆抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab11136)、腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)兔多克隆抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab3760)、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)小鼠單克隆抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab93926)。

1.2 方法

1.2.1 采用膠原酶法制備腦出血大鼠模型：根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10%水合氯醛腹腔麻醉，俯臥位固定在大鼠腦立體定向儀，皮膚消毒，暴露顱骨前囟點(diǎn)，在手術(shù)顯微下用牙科鉆鉆孔，用小號(hào)直紋鉗開(kāi)約2 mm 直徑小顱窗，用微量進(jìn)樣器向右側(cè)尾殼核處緩慢注入2 μl 0.5 U膠原酶，留針10 min后，緩慢退出，鉆孔用骨蠟封閉，逐層縫合后回籠飼養(yǎng)，室溫控制在25℃左右。假手術(shù)組大鼠注射0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 分組與給藥:60只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、大蒜素低、中、高劑量組(15、30、60 mg/kg)，每組12只。術(shù)后30 min進(jìn)行腹腔注射給藥，假手術(shù)組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液，以上均以1 ml/100 g給藥。

1.2.3 神經(jīng)功能評(píng)分:給藥24 h后按Zea Longa評(píng)分法測(cè)定行為學(xué)變化。根據(jù)Zea Longa 推薦的五級(jí)制評(píng)分，并稍作改進(jìn)，對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分：0分：正常，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1 分：對(duì)側(cè)前爪部分屈曲或完全屈曲；2分：向偏癱側(cè)輕度轉(zhuǎn)圈；3 分：向偏癱側(cè)明顯轉(zhuǎn)圈；4 分：向偏癱側(cè)傾倒；5分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.2.4 腦組織含水量:行為學(xué)結(jié)束后，麻醉大鼠，每組取6只大鼠，快速斷頭取腦組織，去掉嗅球、小腦和低位腦干后，分別稱量腦濕重，再置于烘箱中，70℃烘烤24 h至恒重，精確稱量干重，按如下公式計(jì)算腦組織含水量。腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.5 HE染色:每組取3只大鼠，腦組織取材，固定于甲醛，24 h 后做石蠟切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察腦組織的病理變化。

1.2.6 Western-blot方法檢測(cè)大鼠腦組織蛋白表達(dá)水平:每組取3只大鼠，取大鼠腦出血灶周?chē)M織，至于液氮中保存。大鼠腦組織，用組織裂解液冰浴中，充分勻漿，離心，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)腦組織蛋白濃度。按照說(shuō)明書(shū)配制聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白樣本變性分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜在脫脂奶粉溶液中孵育，加入NF200、MAP-2、MBP、GAP43、AMPKα、GSK-3β一抗或內(nèi)參GAPDH進(jìn)行抗原抗體結(jié)合(稀釋度：1∶500)，加入相應(yīng)的二抗于搖床上充分孵育結(jié)合，洗膜后用X膠片采用化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行曝光顯影，用蛋白分析軟件將X膠片掃描后的圖片灰度值進(jìn)行分析，以內(nèi)參灰度值校正，以NF200、MAP-2、MBP、GAP43、AMPKα、GSK-3β/GAPDH灰度值比值代表目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，大蒜素低、中、高劑組神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低(P<0.05或<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 5組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 n=12,分,

2.2 大蒜素對(duì)腦出血大鼠腦含水量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組腦含水量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，大蒜素低、中、高劑組腦含水量明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 5組大鼠腦含水量比較

2.3 大蒜素對(duì)腦出血大鼠病理?yè)p傷的影響 假手術(shù)組大鼠腦組織光鏡下可見(jiàn)，神經(jīng)細(xì)胞排列有序、細(xì)胞核呈橢圓形，核大，均勻規(guī)則；模型組可見(jiàn)細(xì)胞排列紊亂，水腫明顯，細(xì)胞核固縮；大蒜素組病理?yè)p傷比模型組明顯減輕。見(jiàn)圖1。

假手術(shù)組 模型組 大蒜素低劑量組 大蒜素中劑量組 大蒜素高劑量組

2.4 大蒜素對(duì)腦出血大鼠NF200、MAP-2、MBP、GAP43表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織NF200、MAP-2、MBP、GAP43蛋白表達(dá)下降(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素低劑組 MAP-2、MBP、GAP43表達(dá)上升(P<0.05或<0.01)，大蒜素中、高劑組NF200、MAP-2、MBP、GAP43蛋白表達(dá)上升(P<0.05或<0.01)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 5組大鼠腦組織NF200、MAP-2、MBP、GAP43蛋白表達(dá)的變化

圖2 5組大鼠腦組織NF200、MAP-2、MBP、GAP43蛋白表達(dá)的Western-blot檢測(cè)；1 假手術(shù)組；2 模型組；3 大蒜素低劑量組；4 大蒜素中劑量組；5 大蒜素高劑量組

2.5 大蒜素對(duì)腦出血大鼠AMPKα、GSK-3β表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織AMPKα、GSK-3β蛋白表達(dá)上升(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素低劑組GSK-3β蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，大蒜素中、高劑組AMPKα、GSK-3β蛋白表達(dá)下降(P<0.01)。見(jiàn)表4，圖3。

圖3 5組大鼠腦組織AMPKα、GSK-3β表達(dá)的Western-blot檢測(cè)；1 假手術(shù)組；2 模型組；3 大蒜素低劑量組；4 大蒜素中劑量組；5 大蒜素高劑量組

表4 5組大鼠腦組織AMPKα、GSK-3β蛋白表達(dá)變化

3 討論

大蒜素是一種廣譜抗菌藥，臨床上主要用于深部真菌和細(xì)菌感染，同時(shí)大蒜素具有降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗氧化及提高免疫力等多種生物學(xué)功能。大蒜素對(duì)腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究也有大量報(bào)道，Shao等[11]報(bào)道了大蒜素能夠減輕腦水腫、抑制氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡，改善實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠神經(jīng)功能；李春艷等[12]報(bào)道了大蒜素能夠抑制大鼠局灶性腦缺血再灌注后的血液流變學(xué)改變，對(duì)腦缺血損傷大鼠具有良好的保護(hù)作用。本研究采用膠原酶法制備腦出血大鼠模型，我們觀察到腦出血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高，神經(jīng)功能?chē)?yán)重受損，腦水腫含量亦明顯升高，給予大蒜素干預(yù)后，神經(jīng)功能評(píng)分和腦含水量明顯降低，同時(shí)HE染色也顯示了大蒜素能改善腦出血大鼠腦組織的病理?yè)p傷，表明大蒜素能夠減輕腦水腫，改善神經(jīng)功能，對(duì)腦出血大鼠有很好的保護(hù)作用。

大腦神經(jīng)元在死亡后幾乎無(wú)法再生，但已有報(bào)道神經(jīng)元軸突有一定的再生與修復(fù)能力，可幫助腦出血患者的神經(jīng)功能得到一定的恢復(fù)[13]。目前研究最多的神經(jīng)元軸突相關(guān)蛋白有神經(jīng)絲蛋白NF200、微管相關(guān)蛋白MAP-2、髓鞘堿性蛋白MBP等[14,15]。NF200是構(gòu)成神經(jīng)細(xì)胞軸突中間絲的蛋白質(zhì)，可以反映軸突的生長(zhǎng)情況，是神經(jīng)元軸突標(biāo)記物，與微管和微絲一起形成神經(jīng)元細(xì)胞骨架[16]；MAP-2是微管相關(guān)蛋白，與NF200共同參與細(xì)胞骨架形成及軸突發(fā)生，影響神經(jīng)傳導(dǎo)速度[17]；MBP是神經(jīng)系統(tǒng)少突細(xì)胞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)雪旺細(xì)胞合成的一種強(qiáng)堿性膜蛋白，是判斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)破壞程度的重要指標(biāo)[18]；GAP43蛋白與神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)以及突觸可塑性密切相關(guān)[19,20]。本研究觀察到腦出血大鼠出血部位NF200、MAP-2、MBP和GAP43蛋白表達(dá)明顯降低，給予大蒜素治療后，能顯著提高NF200、MAP-2、MBP和GAP43蛋白表達(dá)，表明大蒜素能夠促進(jìn)腦出血后軸突再生。

為進(jìn)一步研究大蒜素對(duì)腦出血后軸突再生的機(jī)制，我們對(duì)AMPK/GSK-3β信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè)。AMPK是調(diào)節(jié)生物能量代謝的重要分子，是代謝研究中的核心因子參與腦細(xì)胞的代謝。GSK-3β作為信號(hào)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、存活和凋亡，已有研究報(bào)道了降低GSK-3β活性可調(diào)控細(xì)胞骨架，促進(jìn)微管穩(wěn)定性，增加軸突的再生[21]。本研究結(jié)果顯示腦出血后AMPK和GSK-3β表達(dá)下降，AMPK/GSK-3β信號(hào)通路下調(diào)，大蒜素能明顯上調(diào)AMPK/GSK-3β通路，結(jié)合上述的軸突再生相關(guān)蛋白NF200、MAP-2、MBP和GAP43表達(dá)上升，表明大蒜素干預(yù)后，可以降低腦組織AMPK水平，抑制神經(jīng)元GSK-3β活性，提高軸突再生相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)軸突再生，改善腦出血大鼠神經(jīng)功能，發(fā)揮其腦組織保護(hù)的作用。